依帕司他对四氯化碳致小鼠慢性肝损伤的保护作用及机制研究

张跃华 杨风 续婷婷 朱书霞 陈格 赵红

(青岛大学附属青岛市中心医院，山东 青岛 266042)

慢性肝损伤由肝炎病毒、酒精、自身免疫、代谢、药物等多种因素导致，如不及时治疗，最终会发展为肝硬化，甚至肝衰竭[1]。因此，阻止慢性肝损伤的进展，具有重要的临床意义，是当前国内外研究的热点。依帕司他是醛糖还原酶抑制剂，可以减少山梨醇生成，改善细胞内高渗透压状态[2]；减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)消耗，改善NADPH/NADP+(NADPH的氧化形式)失衡，提高细胞抗氧化能力[3]。目前有研究表明，在酒精诱导的肝损伤小鼠中使用依帕司他，小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平下降，内质网应激相关蛋白表达减少[4]；依帕司他亦可改善蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠肝损伤，减少肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6表达[5]；此外，依帕司他还可提高机体抗氧化能力，改善2型糖尿病大鼠氧化应激导致的肝损伤[6]。但依帕司他对化学药物致小鼠慢性肝损伤的保护机制，目前国内外鲜见报道。本实验通过采用CCl4建立经典化学性肝损伤模型，探讨依帕司他对化学药物致小鼠慢性肝损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源

SPF级雄性C57BL/6J小鼠75只,6周龄,体质量19～21 g，购于北京维通利华公司,许可证号SCXK(京)2016-0006。

1.2 药品、试剂与仪器

依帕司他(扬子江药业公司)，甘草酸二铵(正大天晴公司)，TUNEL试剂盒(武汉赛维尔公司)，兔抗小鼠B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)一抗(武汉爱博泰克公司), ELISA试剂盒(上海博湖公司)，酶标仪(美国赛默飞公司)，全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.3 方法

1.3.1动物分组及处理 75只小鼠适应性喂养1周后,随机分为正常组(A组)、模型组(B组)、阳性对照组(C组)、依帕司他低剂量组(D组)以及依帕司他高剂量组(E组)，每组15只小鼠。A组小鼠腹腔注射橄榄油(2 mL/kg)，其余各组小鼠腹腔注射等量体积分数0.20的CCl4橄榄油溶液，每周2次，持续8周。B～E组随机抽取1只小鼠处死后取肝组织制作病理切片，若切片中发现肝细胞水肿、坏死及炎症细胞浸润，则慢性肝损伤小鼠模型构建成功。然后A、B组小鼠灌胃生理盐水4 mL/kg,C组小鼠灌胃甘草酸二铵50 mg/kg，D、E组小鼠分别灌胃依帕司他50、100 mg/kg，每天1次，给药4周。末次给药后,小鼠禁食12 h。各组小鼠摘除眼球取血，断颈处死所有小鼠，快速解剖，取出小鼠肝脏备用。

1.3.2小鼠血清中ALT、AST水平的检测 分离血清，全自动生化测定仪检测小鼠血清中ALT及AST水平。

1.3.3小鼠肝组织病理检查 切取各组小鼠肝右叶，经40 g/L甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、切片、烘烤处理后，HE染色，光学显微镜下观察小鼠肝组织病理变化。

1.3.4小鼠肝细胞凋亡情况的检测 取各组小鼠新鲜肝组织做成石蜡切片，按照TUNEL试剂盒所示步骤操作，荧光显微镜下观察，凋亡细胞的细胞核为绿色荧光，采集图像，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=显微镜视野下凋亡细胞数/总细胞数。

1.3.5小鼠肝组织的氧化应激指标的检测 制备小鼠肝组织匀浆，3 000 r/min离心10 min,取上清液。按照ELISA试剂盒说明书要求的步骤，测定各组小鼠肝组织匀浆上清液中丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性。

1.3.6小鼠肝组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及Caspase-3表达量的测定 裂解小鼠肝组织提取总蛋白，12 000 r/min离心5 min,收取上清液，使用BCA法检测蛋白浓度。以20 μg蛋白量计算每组的上样体积，上样至含体积分数0.10的SDS-PAGE凝胶孔中，电泳、转膜、封闭。将封闭后的膜放入1∶1 000稀释后的Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗工作液中，4 ℃反应过夜。洗膜后放入1∶10 000稀释后的二抗工作液中，室温避光孵育。洗涤后进行曝光及洗片，用Image J软件分析灰度值，以β-actin为内参，计算Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白的相对表达量。

1.4 数据处理

2 结 果

2.1 各组小鼠血清中ALT、AST水平比较

各组小鼠血清中ALT、AST水平比较差异有显著性(F=12.00、7.42，P<0.05)。与A组相比，B组小鼠血清中ALT、AST水平显著升高(t=5.54、3.67,P<0.05)；与B组相比，C、D、E组小鼠血清中ALT以及AST水平显著降低(t=4.24～5.44,P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清中ALT、AST水平比较

2.2 各组小鼠肝组织病理变化比较

A组小鼠肝组织中肝小叶结构正常，肝索排列整齐，肝窦无明显扩张，肝细胞无明显水肿，未见明显炎性细胞浸润，仅见极少量点状坏死(图1A)。B组小鼠肝组织可见肝细胞明显水肿，肝索排列紊乱，部分区域有明显桥接坏死出现，汇管区及部分胆管可见大量炎性细胞聚集(图1B)。C、D、E组小鼠肝组织中肝小叶排列较为规整，细胞水肿较轻，可见少量点状和灶状坏死，部分汇管区及胆管内有少量炎性细胞浸润，其中E组改善较D组更为明显(图1C、D、E)。见图1。

A～E分别为A～E组，HE染色法，100倍

2.3 各组小鼠肝细胞凋亡率比较

A～E组小鼠肝细胞凋亡率分别为0.001 6±0.000 5、0.006 2±0.002 9、0.001 2±0.000 8、0.003 6±0.001 8、0.001 6±0.000 9。各组小鼠肝细胞凋亡率比较差异有显著性(F=7.99，P<0.05)；与A组相比，B组小鼠肝细胞凋亡率显著上升(t=4.38,P<0.05)；与B组比较,C、E组小鼠肝细胞凋亡率显著下降(t=4.76、4.38,P<0.05)。

2.4 各组小鼠肝组织中氧化应激指标比较

各组小鼠肝组织中MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性比较差异有显著性(F=3.36～8.70，P<0.05)；与A组相比，B组小鼠的肝组织中SOD、GSH-Px、CAT的活性明显下降(t=3.45～5.20,P<0.05)；与B组相比，D、E组小鼠肝组织中MDA含量明显下降(t=3.58、4.98,P<0.05),C、D、E组小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、CAT的活性明显上升(t=2.14～4.64,P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肝组织中MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性比较

2.5 各组小鼠肝组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达量比较

各组小鼠肝组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达量比较差异有显著意义(F=5.29～8.39,P<0.05)；与A组相比，B组小鼠肝组织中Bcl-2蛋白表达显著下调(t=5.10,P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白表达显著上调(t=4.44、4.40,P<0.05)；与B相比，C、D、E组小鼠肝组织中Bcl-2蛋白表达显著上调(t=2.97～4.71,P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白表达显著下调(t=2.75～4.36,P<0.05)。见图2、表3。

图2 各组小鼠肝组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达量比较

表3 各组小鼠肝组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达量比较

3 讨 论

慢性肝损伤是由多种病因引起的肝脏慢性炎症[7]。CCl4作为化学药物，进入机体以后会破坏肝细胞结构，引起肝细胞坏死，最终导致了肝细胞内的ALT、AST等物质入血[8]。血清中ALT、AST水平是反应肝损伤最常用的指标[9]。本研究发现，D、E组小鼠血清中ALT、AST水平明显低于B组，差异有显著性，这表明依帕司他可降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST水平，对于CCl4诱导的小鼠慢性肝损伤有保护作用。病理检查是诊断肝损伤的“金标准”[10]，B组小鼠肝组织病理检查可见肝细胞明显水肿，部分区域可见桥接坏死，并见大量炎性细胞浸润。D、E组小鼠肝组织病理检查结果显示肝细胞水肿比较轻微，仅仅发现有少量点状或者灶状坏死，同时少量炎性细胞浸润，与C组小鼠肝组织镜下结果相仿，表明依帕司他亦可以保护肝细胞结构，减轻肝组织炎症反应，对CCl4诱导的小鼠肝损伤发挥了保护作用。

氧化应激是慢性肝损伤发生和发展的重要机制[11]。氧自由基(ROS)过量生成和抗氧化能力不足使体内氧化/抗氧化系统失衡，导致氧化应激[12]。CCl4的代谢产物攻击肝细胞膜上的多不饱和脂肪酸，导致脂质过氧化，生成ROS[8]。MDA是细胞膜发生脂质过氧化的最终产物，肝脏MDA含量增加表明脂质过氧化增强，提示肝脏氧化/抗氧化系统失衡[13]。本研究结果显示，D、E组小鼠肝脏中MDA含量较B组显著减少，提示依帕司他可以减弱肝细胞脂质过氧化的程度。机体为维持内环境稳态，还存在多种抗氧化酶，如SOD、GSH-Px、CAT等，持续清除各种反应产生的ROS，使氧化/抗氧化系统达到一种稳态平衡。SOD可以有效地清除超氧阴离子，将超氧阴离子分解成为过氧化氢(H2O2)[14]。GSH-Px和CAT将H2O2分解成为水和氧气[15-16]。本研究结果显示，D、E组与B组相比，小鼠肝脏中SOD、GSH-Px、CAT活性显著增加，提示依帕司他可以通过提高肝脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性，增强清除ROS的能力，维持肝脏氧化/抗氧化系统的平衡。GSH-Px还可利用NADPH将氧化型谷胱甘肽催化为还原型谷胱甘肽(GSH)，提高细胞抗氧化能力[17]。由此可以推测依帕司他可通过减少NADPH消耗，增加GSH生成，增强肝细胞抗氧化能力。葡萄糖在多元醇代谢途径中，会产生大量的ROS[18]，依帕司他通过抑制醛糖还原酶生成，减少葡萄糖进入多元醇代谢途径，减少ROS生成，提高肝细胞抗氧化能力。这表明依帕司他可以通过抑制多种机制引起的氧化应激，保护CCl4诱导的小鼠慢性肝损伤。

细胞凋亡是肝损伤的主要特征之一[19]。本研究中发现，B组小鼠肝细胞凋亡率显著升高，E组小鼠肝细胞凋亡率明显低于B组，提示依帕司他可以减少肝细胞凋亡，对CCl4诱导的小鼠慢性肝损伤起保护作用。然而，D组与B组相比，小鼠肝细胞凋亡率无显著差异，考虑与药物剂量不足有关，提示依帕司他与抑制肝细胞凋亡可能存在剂量-反应关系。肝细胞凋亡机制复杂，需要多种蛋白参与调控[20]。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中起重要调控作用，Bcl-2和Bax是线粒体凋亡的关键蛋白[21]。Bcl-2是凋亡抑制蛋白，主要通过保护线粒体的功能和抑制Caspase激活抑制细胞凋亡[22]。Bax是促凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中从胞浆移动到线粒体，改变线粒体膜通透性，释放细胞色素C，破坏线粒体功能,诱发细胞凋亡[23]。Bcl-2和Bax在细胞膜上相互作用，变化构象，调控细胞凋亡[24]。本研究结果显示，相比于B组，D、E组小鼠肝组织中Bcl-2蛋白表达显著上调，而Bax蛋白的表达显著下调，表明依帕司他可以通过调控小鼠肝细胞线粒体凋亡的关键蛋白，影响肝细胞线粒体代谢，抑制肝细胞线粒体凋亡途径，从而可以减少肝细胞凋亡。Caspase-3位于细胞凋亡途径下游，在细胞内通常以无活性的pro-Caspase-3存在，它的激活是通过蛋白酶裂解某个亚基启动。激活的Caspase-3选择性地分割不同底物，激活凋亡级联反应，最终导致肝细胞凋亡[25]。本研究中，D、E组较B组小鼠肝组织中Caspase-3蛋白表达显著下调，提示依帕司他可能是在小鼠肝细胞凋亡途径的下游发挥阻断作用，抑制小鼠肝细胞凋亡。

综上所述，通过本研究可发现依帕司他可以显著降低CCl4诱导的慢性肝损伤小鼠血清中ALT、AST水平，减少肝细胞凋亡，其作用机制可能与抑制氧化应激，调控凋亡相关蛋白表达有关。依帕司他在改善肝损伤方面有良好临床应用前景，其确切的机制还有待于进一步深入研究，以探讨其临床应用的可行性。