阿司匹林对子痫前期发病的预防作用及机制

刘亚军 赵蕾 石萍 张文轲 张宁

(青岛大学附属医院产科，山东 青岛 266555)

子痫前期(PE)是发生于妊娠期间的一种疾病，患者主要表现为高血压及蛋白尿，可导致子痫、胎盘早剥、胎儿生长受限、早产等严重的母儿并发症。目前，PE的病因尚未完全阐明，关于其发病机制有多种学说，螺旋动脉的滋养细胞浸润不足及子宫胎盘局部缺血缺氧是比较重要的学说之一。基质金属蛋白酶(MMP)在子宫胎盘血管重建中有着重要作用。研究显示MMP-2、MMP-9在 PE患者胎盘组织中表达水平下调[1]，但具体的调控机制并不清楚。炎性学说是PE发病的另一重要机制，PE患者血清及胎盘中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种炎性因子水平明显升高[2]，胎盘缺血也会刺激母体血液及胎盘中TNF-α的释放[3]。研究显示，TNF-α可能是通过影响MMP的表达参与子宫血管异常重建并导致胎盘缺血[4]，但对于PE发生时血清中TNF-α与胎盘组织中MMP-2、MMP-9相关性研究报道不多。目前，建议PE高风险孕妇在妊娠12周后每日口服小剂量阿司匹林以预防PE，而在妊娠>16周后服用效果不佳，妊娠第12～16周正是胎盘发育的关键时期，因此推测阿司匹林可能是通过改善胎盘血管重建发挥预防作用的。本研究旨在探讨TNF-α是否是通过抑制胎盘组织中MMP-2及MMP-9的表达及活性参与PE的发病，而阿司匹林是否通过减弱TNF-α的抑制作用而达到预防PE发病的。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年2—5月在我院产科行剖宫产的20例PE产妇作为研究对象(PE组)，另选取同期行剖宫产的20例正常妊娠产妇作为对照组(NP组)。排除胎膜早破及合并感染性疾病者。两组研究对象的年龄、孕周、体质量指数、产次比较差异均无统计学意义(P>0.05)。临床样本的采集、使用均获患者知情同意。

1.2 样本的采集及处理

所有研究对象在术前空腹状态下采集静脉血，离心后分离血清，以ELISA法检测血清中TNF-α的表达水平。剖宫产时留取胎盘组织，-80 ℃保存备用。

1.3 Western-blot法测定人胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达水平

取人胎盘组织60 mg，剪碎，加入300 μL蛋白裂解液，匀浆，4 ℃下12 000 r/min离心15 min后取上清液；测定蛋白浓度后，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，以体积分数0.05脱脂奶粉封闭，分别加入单克隆兔抗MMP-2抗体(1∶1 000)、单克隆兔抗MMP-9抗体(1∶1 000)孵育过夜；洗膜后加入辣过氧化物酶标记的羊抗兔二抗( 1∶1 000)孵育2 h，以β-actin作为内参照，曝光后用Image J软件分析条带的灰度值，以目的蛋白/内参蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平，实验均重复3次，结果取均值。

1.4 妊娠大鼠处理及样本采集

妊娠11 d的Sprague-Dawley大鼠18只(查尔斯河实验室)，体质量205～350 g，标准食物喂饲，自由饮水，在12-12 h昼夜循环环境中生长。在妊娠第14天，将大鼠随机分为正常妊娠组(C组)、TNF-α组(B组)、TNF-α+阿司匹林组(A组)，每组6只大鼠。妊娠第14天，所有大鼠吸入异氟烷麻醉后行颈静脉置管， C组大鼠经颈静脉每天将50 mL生理盐水持续泵入，B组大鼠每天将TNF-α 50 ng加入到生理盐水50 mL中持续泵入， A组在B组处理的基础上同时给予掺有阿司匹林的啮齿动物面团喂养，均连用5 d。阿司匹林的剂量参照目前高危孕妇推荐的100 mg/d 的剂量[5]进行换算，为阿司匹林1.5 mg/kg。至妊娠第19天，通过吸入CO2致大鼠安乐死，打开腹腔切开妊娠子宫，取出胎盘组织，-80 ℃保存备用。所有程序均严格按照《实验动物科学与管理》的相关规定进行。

1.5 Western-blot方法测定大鼠的胎盘组织当中MMP-2、MMP-9的表达水平

取大鼠胎盘组织，同1.3中的方法检测各组大鼠胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达水平，实验均重复3次，结果取均值。

1.6 明胶酶谱法测定大鼠胎盘组织中MMP-2、MMP-9的活性

同1.3中的方法裂解蛋白，裂解液不含DTT；提取蛋白后进行SDS-PAGE凝胶电泳(分离胶中加入浓度为1 g/L的明胶)，跑胶后，取出胶加入复活缓冲液反应0.5 h恢复酶的活性；再将胶放至反应缓冲液中37 ℃孵育过夜，第2天以5 g/L的考马斯亮蓝染色0.5 h，反应缓冲液脱色至出现白色条带，采用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白/内参蛋白条带的灰度值比值表示目的蛋白酶的活性。

2 结 果

2.1 两组血清中TNF-α以及胎盘组织中MMP-2、MMP-9表达水平比较

PE组和NP组患者血清中TNF-α的表达水平分别为(349.8±10.46)、(236.5±11.82)ng/L，两组比较差异有显著性(t=7.18，P<0.05)。PE组患者胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达水平分别为0.72±0.01、0.75±0.01，NP组患者分别为0.85±0.01、0.83±0.01，两组比较差异有显著性(t=6.52、5.81,P<0.05)。见图1。

相关性分析结果显示，PE患者血清中TNF-α的表达水平与胎盘组织中MMP-2、MMP-9表达水平呈负相关(r=-0.64、-0.61，P<0.05)。

2.2 3组妊娠大鼠胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达水平及活性比较

A、B、C组大鼠胎盘组织中MMP-2表达水平分别为0.25±0.04、0.11±0.02、0.22±0.03，MMP-9的表达水平分别为0.44±0.06、0.18±0.02、0.34±0.05，3组比较差异有显著意义(F=56.21、126.50，P<0.05)，其中B组大鼠的胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达水平均明显低于C组，A组均明显高于B组(t=9.62～16.36，P<0.05)。见图2。

图2 3组妊娠大鼠胎盘组织中MMP-2、MMP-9表达水平比较

A、B、C组妊娠大鼠胎盘组织中MMP-2活性分别为0.37±0.07、0.19±0.08、0.27±0.08，MMP-9的活性分别为0.98±0.45、0.38±0.26、0.65±0.35，3组比较差异均具有显著意义(F=7.53、4.05，P<0.05)，其中B组大鼠胎盘组织中MMP-2、MMP-9的活性均明显低于C组，A组均明显高于B组(t=2.83～4.15，P<0.05)。见图3。

图3 3组妊娠大鼠胎盘组织中MMP-2、MMP-9活性比较

3 讨 论

PE是一种妊娠相关的特发性疾病，其主要的临床特点是高血压，有时伴有蛋白尿和水肿，可导致胎儿宫内生长受限、胎盘早剥、医源性早产等严重并发症[6-7]。PE患者临床普遍采用降压、解痉、镇静等药物治疗，但因病因复杂，治疗效果较差，甚至不得不终止妊娠。但即使终止妊娠后，部分患者仍然长期伴有慢性高血压或者其他心血管系统疾病[8]。因此明确PE的具体发病机制对于该病的预防及治疗意义重大。

目前认为，PE的发病可能与胎盘浅着床、遗传易感性、过度炎症反应、内皮细胞功能障碍、母胎免疫平衡失调等多种因素有关，其中关于子宫胎盘灌注压减少及其导致的胎盘缺血缺氧的机制比较受关注，认为胎盘缺血缺氧可能会增加全身及胎盘局部生物活性因子的释放，继而发生广泛性血管功能障碍，并导致高血压。该机制涉及到血管系统、免疫系统及炎症反应因素等，各因素间具有相互影响[9-10]。

研究表明，胎盘血管重建异常是导致胎盘缺血缺氧的关键因素，滋养细胞侵袭能力等多种因素与胎盘血管重建、胎盘缺血缺氧等密切相关[11-12]，其中MMP是调节胎盘血管重建的关键因子[13]。MMP是一类可降解细胞外基质和结缔组织的蛋白酶，其中MMP-2和MMP-9在动物和人类的妊娠组织重塑及胎盘血管重建中均具有重要作用。研究显示，正常妊娠大鼠的子宫肌层和主动脉组织中MMP-2、MMP-9的表达上调[4]，且MMP-2、MMP-9基因多态性与PE的发病相关[14]。本研究结果表明，PE患者胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达低于正常妊娠者，与OMRAN等[15]的研究结果一致。MMP表达水平降低会导致胶原细胞过度沉积，从而影响子宫平滑肌细胞生长和抑制滋养细胞侵入螺旋动脉，影响胎盘血管重塑。此外，MMP的异常表达可能还会导致母体耐受性降低、侵袭性滋养细胞凋亡、螺旋动脉重塑不足以及子宫灌注压降低等一系列反应[16]。因此在理论上调控MMP的表达水平可能会改善子宫胎盘血管重建，从而降低PE的发生概率，而调控MMP表达的上游因子目前尚不清楚。

研究发现，血液循环系统中TNF-α等多种炎性因子水平升高，可能是导致PE发病的重要因素[17]。LI等[18]研究显示，TNF-α可促进缺血诱导的PE模型大鼠子宫胎盘组织中MMP-1和MMP-7的表达。因此推测TNF-α可能是通过影响MMP的表达参与了PE发病，所以本研究进一步分析了TNF-α与MMP表达的相关性。本研究结果显示，B组胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达水平及活性下降，且PE患者血清中TNF-α的表达水平与胎盘组织中MMP-2、MMP-9表达水平呈负相关。提示TNF-α可能是MMP的上游调节因子，通过抑制胎盘组织中MMP-2、MMP-9表达，致妊娠时子宫胎盘重塑不足、血管内皮细胞功能障碍，从而诱发PE。

临床研究显示，高危孕妇早期服用低剂量阿司匹林可降低早期PE发病风险[19]。SUN等[20]研究发现，阿司匹林可通过抑制胎盘及血清中炎性因子释放来改善脂多糖诱导的PE样症状。XU等[21]研究显示，TNF-α可抑制滋养细胞向内皮细胞网络的整合，阿司匹林可抑制TNF-α的这一作用，改善滋养细胞与内皮细胞网络整合的能力。本研究结果显示，阿司匹林可逆转孕鼠血清中TNF-α对MMP-2、MMP-9的抑制作用，提示阿司匹林可能是通过逆转血循环中TNF-α对MMP-2、MMP-9的抑制作用这一途径，改善胎盘血管重建，从而预防PE的发生。

综上所述，本研究显示，TNF-α可能通过抑制胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达及活性参与PE发病。阿司匹林可抑制TNF-α的这一作用，从而提高胎盘组织中MMP-2、MMP-9的表达水平及活性，此可能是阿司匹林预防PE的潜在机制，但具体的分子机制还有待于细胞实验进一步研究。