基于网络药理学探讨西黄丸抑制三阴性乳腺癌关键靶点及免疫学机制❋

郭秋均 ，孙其伟

(1.中国中医科学院广安门医院肿瘤科， 北京 100053；2.中国中医科学院西苑医院预防保健科，北京 100091)

西黄丸是经典的抗肿瘤名方，由牛黄、麝香、乳香、没药等组成，具有清热解毒、消肿散结之功效，可以治疗乳岩、横、瘰、痰核等恶疾。目前西黄丸多以单用或配合现代抗肿瘤手段治疗乳腺癌等肿瘤疾病。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)约占乳腺癌总发病率的15%～20%，由于缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2，对化疗敏感性差，缺乏内分泌、靶向治疗等治疗手段，通常被认为是最难治疗的乳腺癌亚型[1]，免疫治疗是其潜在有效治疗方案[2]。既往研究发现，西黄丸治疗三阴性乳腺癌有一定疗效，但其作用机制有待进一步明确。网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分析的方法，开启了中医药多靶标与多种疾病间复杂网状关系研究的新模式。本研究拟通过网络药理学对西黄丸治疗三阴性乳腺癌的关键靶点及其免疫学机制进行分析。

1 材料与方法

1.1 中药复方作用靶点的筛选

利用中药系统药理学数据库(TCMSP，traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform https://tcmspw.com/tcmsp.php)对牛黄、麝香、乳香、没药以生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18且药物半衰期(HL)≥4作为阈值进行筛选，对复方中药的药物作用靶点进行研究，OMIM数据库(online mendelian inheritance in man，https://omim.org/)、Genecard数据库(http://www.genecards.org/)以及TCGA数据库用于筛选三阴性乳腺癌的病理靶点。通过Venn图对中药药物靶点以及三阴性乳腺癌病理靶点进行整合，以确定潜在中药治疗三阴性乳腺癌的作用机制。

1.2 TCGA数据获取

通过TCGA数据库(The cancer genome atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/)下载并处理乳腺癌原始的mRNA表达数据，并分离出三阴性乳腺癌表达谱，探讨三阴性乳腺癌的差异基因，差异筛选条件为LogFC> 2 & adj.P<0.05。利用limma包对下载的mRNA level 3的FPKM数据进行整合和标准化，分析差异表达基因及其表达水平，差异基因筛选条件为 LogFC>2 &P<0.05。

1.3 筛选复方中药治疗三阴性乳腺癌的最佳靶点并构建网络

使用STRING在线数据库11.0(https://string-db.org)对牛黄、麝香、乳香、没药抗三阴性乳腺癌作用靶点进行评估，并将置信度得分>0.4作为截点标准，得到一个靶-靶功能相关蛋白网络、蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络。此外，利用Cytoscape (version3.7.1) 中的Network Analyzer用于分析网络中的拓扑参数，如中值degree和最大degree。进一步通过Cytoscape软件可视化生成的PPI网络，分析关键基因在疾病发生发展中的作用，探讨疾病与基因表达的相关性。

1.4 GO和KEGG功能注析

利用R包“clusterprofiler”对核心靶点进行GO(gene oncology)富集和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，探讨目标基因的功能相关性。p值和q值均小于0.05的GO和KEGG富集通路被认为是显著性类别。

1.5 免疫细胞浸润分析

采用CIBERSORT算法对三阴性乳腺癌患者RNA-seq数据进行分析，用以推断22种免疫浸润细胞的相对比例，并对基因表达量以及免疫细胞含量进行spearman 相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1.6 统计学方法

采用R语言(version 3.6)进行统计分析，所有统计检验均为双侧，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三阴性乳腺癌靶点基因筛选

通过TCGA数据库分选三阴性乳腺癌数据集，包括正常组113例、肿瘤组158例，分离出三阴性乳腺癌基因表达谱，共筛选出458个差异基因(图1)，其中上调基因153个，下调基因305个。进一步通过OMIM数据库以及GeneCards数据库(Relevance score≥20)探讨三阴性乳腺癌的相关靶点1973个，取差异基因与疾病数据库交集基因131个。

注：a.TCGA数据库筛选三阴性乳腺癌差异基因火山图；b.TCGA数据库筛选三阴性乳腺癌458个差异基因表达谱；c.OMIM数据库与GeneCards数据库差异基因交集图1 三阴性乳腺癌差异基因筛选比较

2.2 西黄丸作用于三阴性乳腺癌关键基因分析

对TCMSP数据库分别基于牛黄、麝香、乳香、没药这4种中药获取所含药物有效成分以及有效成分所作用的靶点共301个，并使用Cytoscape通过网络图的形式展示中药成分与靶点的作用关系(图2)，再将药物靶点与前者的131基因取交集，得到19个交集基因(图3)。进一步通过单因素Cox和生存分析，筛选其中与肿瘤患者生存预后相关的基因，其中共识别4个关键基因，即CXC趋化因子配体10(Chemokine ligand-10，CXCL10)、腺病毒E2启动子转录因子1(E2F transcription factor 1，E2F1)、AP-1转录因子亚单位(AP-1 transcription factor subunit，FOS)、凝血因子3(Coagulation factor III，F3)，其中CXCL10、E2F1是三阴性乳腺癌保护性因素，FOS、F3是三阴性乳腺癌预后危险因素(图4)。

图2 西黄丸组分牛黄、麝香、乳香、没药有效成分靶向分析

图3 西黄丸药物组分有效靶点与三阴性乳腺癌疾病靶点交集分析

注：a.CXCL10改善三阴性乳腺癌10年生存时间(p=0.015)；b.E2F1改善三阴性乳腺癌10年生存时间(p=0.014)；c.F3降低三阴性乳腺癌10年生存时间(p=0.010);FOS降低三阴性乳腺癌10年生存时间(p=0.026)图4 西黄丸干预三阴性乳腺癌关键基因生存预后分析

2.3 西黄丸干预三阴性乳腺癌潜在网络通路机制

GO 富集分析筛选得到GO条目25条 (P<0.05)，涉及生物过程10条，细胞组成6条，分子功能9条(图5)。KEGG富集结果显示，4个核心基因主要涉及通路11条，主要涉及为白介素-17(Interleukin-17, IL-17)、Toll样受体(Toll-like receptor)和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)等信号通路(图6)。

图5 西黄丸干预三阴性乳腺癌关键基因GO分析

图6 西黄丸干预三阴性乳腺癌关键基因KEGG分析

2.4 西黄丸干预三阴性乳腺癌核心靶点通路交互分析

采用Cytoscape软件，生成西黄丸抑制三阴性乳腺癌靶点的网络可视化和核心靶点相关通路的交互图，图表能清晰地显示西黄丸上调E2F1、CXCL10和下调FOS、F3的分子机制及其对三阴性乳腺癌的调控作用(图7)。

图7 西黄丸干预三阴性乳腺癌核心靶点通路交互分析

2.5 西黄丸干预三阴性乳腺癌关键靶点与肿瘤免疫细胞浸润的关系

通过进一步探讨西黄丸干预三阴性乳腺癌潜在的免疫学分子机制，研究结果表明，CXCL10与记忆T细胞活化正相关，与M2型巨噬细胞表达负相关；E2F1与滤泡型辅助T细胞(follicular helper T cell，Tfh)表达正相关，与静止记忆T细胞负相关；F3与静止树突状细胞(dendritic cell，DC)正相关，与Tfh表达负相关；FOS与静止记忆T细胞正相关，与M0表型巨噬细胞表达负相关(图8)，说明西黄丸可能是通过上调CXCL10、E2F1，下调F3、FOS从而抑制M2表型巨噬细胞，与促进Tfh细胞表达、DC细胞和记忆T细胞活化等机制有关。

a.CXCL10；b.B:E2F1；c.F3；d.FOS图8 西黄丸干预三阴性乳腺癌关键靶点与肿瘤免疫细胞浸润的关系

3 讨论

乳腺癌属于中医学“乳岩”“乳石痈”范畴，其病机为肝郁脾虚、气血瘀滞、痰瘀毒聚发为乳岩，病属本虚标实[3]。痰瘀凝聚经络是三阴性乳腺癌形成与进展的重要机制，活血化瘀化痰是三阴性乳腺癌的重要治法。

三阴性乳腺癌是临床难治型乳腺癌亚型。本研究通过药物靶点与疾病差异基因交集分析发现，西黄丸调控4个乳腺癌预后关键基因。其中CXCL10是趋化因子超家族中的1种，与相应趋化因子受体结合，调控半胱天冬酶(caspase)家族等通路激酶，促进肿瘤细胞凋亡，调节免疫应答、血管生成。E2F1是细胞周期G1期向S期转变的重要调节因子，磷酸化后可与DNA结合阻止转录过程。E2F1同时还可通过调控p53、p73、caspase家族等多种蛋白抑制肿瘤细胞抗凋亡途径。Fos是原癌基因，是AP-1转录因子亚单位，其基因编码的亮氨酸拉链蛋白可以与JUN家族的蛋白二聚，从而形成转录因子复合物AP-1、FOS蛋白被认为是细胞增殖、分化和转化的调节因子[4]。近年来的研究发现，凝血酶通过多种途径促进肿瘤的生长、转移及血管新生F3生存分析发现，F3高表达与三阴性乳腺癌的不良预后有关，而西黄丸可能通过降低F3的表达，从而影响三阴性乳腺癌的预后。

肿瘤微环境显著影响着肿瘤的诊断、生存结局和临床治疗敏感性。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)根据其功能不同，普遍将其分为M1型与M2型两类[5]。通常认为，M2型巨噬细胞释放CXCL家族趋化因子，IL-6、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促进肿瘤侵袭转移[6]。分析结果提示，西黄丸的作用靶点可能与M2型巨噬细胞相关。记忆T细胞是T细胞中的重要亚群，在乳腺癌免疫应答的启动阶段，CD4+记忆T细胞对CD8+T细胞衰竭有抑制作用[7]，而西黄丸作用于E2F1对记忆T细胞有潜在的调控作用。Tfh是一种特殊类型的辅助性T细胞，通过影响B细胞功能与迁移在非特异性免疫应答过程中发挥关键作用[8]。在三阴性乳腺癌中，被免疫检查点抑制剂激活的Tfh细胞可调节B细胞产生IgG抗体，这些抗体对免疫治疗的疗效至关重要。若抑制B细胞生成这些抗体，免疫治疗效果就会严重受限。此外，CXCL10是肿瘤相关巨噬细胞极化与自噬机制研究中的重要靶点，同时也是影响T细胞功能的重要分子[9]。本研究通过网络药理学手段，揭示了西黄丸在调节三阴性乳腺癌关键靶点和肿瘤微环境中的潜在重要靶点，为中医药防治三阴性乳腺癌的临床与机制研究提供了新思路，但其中具体的因子和细胞表达需要进一步的实验印证。