基于“肾藏精起亟”理论观察补肾活血复方通过干预klotho改善心梗后心衰大鼠心肌纤维化

刘贤娴，张艳，徐瑶，孙晓宁，邹文聪，申欣宜，王雅琴

1 辽宁中医药大学 辽宁沈阳 110847

2 辽宁中医药大学附属医院 辽宁沈阳 110032

心力衰竭是一种临床表现极为复杂的综合征，提示心脏作为泵的效率受损[1]。根据病情发展的时间和速度，划分为急、慢性心衰，临床上常见患者急性心衰住院治疗后症状缓解，转归为慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）[2]。CHF是由各种致病因素的影响下，导致心室充盈和 （或）射血能力受损而引起的一组综合征，是各种心血管系统疾病的终末阶段[3-4]，是全球公共卫生的一大难题。已有研究证明引起CHF的最常见原因是心肌梗死（MⅠ），MⅠ主要是由心室重构引起的病变，而心室重构的基础病理是心肌纤维化[5]。临床治疗CHF基本依靠药物，西医中的代表药物是卡托普利，但有研究指出西药对心肌梗死后纤维化能够起到改善的作用，但效果不显著，且容易反复发作[6]。

本研究通过观察补肾活血复方对CHF大鼠干预后，心功能、心、肾组织蛋白及纤维化的变化，证实本方对心梗后心衰大鼠心肌纤维化很好的预防作用，为中医药治疗CHF提供了新的策略。

材料与方法

1 实验材料

1.1 药物 补肾活血复方，主要成分：菟丝子、黄精、黄芪、丹参、人参、红花、益母草、三七，成品由辽宁中医药大学附属医院药剂中心提供。卡托普利片，规格：25mg*100片（旭东海普药业，H31020564）。

1.2 动物 12周龄雄性WKY大鼠60只，体重（200±20）g（辽 宁 长 生 生 物，SCXK（辽）2015-0001）。严格按照SPF级别饲养。

1.3 主要试剂及仪器 RⅠPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝）；蛋白质电泳、转印缓冲液（北京酷来搏）；ECL显色试剂盒（美国GE公司）；Klotho一抗、内参GAPDH一 抗、Col 1a1一 抗、二 抗 羊 抗兔ⅠgG-HRP（美国Abcam公司）；德国LeicaPJ-1A型烤片机（天津天利航空机电有限公司）；MS-2000多媒体化生物信号记录分析系统（龙飞达科技有限公司）等。

2 实验方法

2.1 CHF大鼠造模 大鼠麻醉成功后，连接心电图，并记录术前心电图（图1）。再行左冠状动脉前降支结扎术，我们可以看到局部收缩力降低，且心肌由红色变为白色，心电图显示ST段明显抬高[7， 8]（图2），证明成功造成心梗模型。Sham组显露冠脉后仅挂线不结扎。术后7d内，每天都予以4组常规饲料喂养，同时予以青霉素钠5万单位，预防感染。从第14～28天的饲料减至常规喂养量1/2，配合每天1次的力竭式游泳训练。造模结束后要及时做检测心脏彩超，射血分数≤60，则代表造模成功[9]。

图1 大鼠冠状动脉结扎前心电图

图2 大鼠冠状动脉结扎后心电图

2.2 分组与药物治疗 造模成功后，Sham组死亡4只，剩余11只，实验组45只大鼠死亡16只，剩余29只，将29只大鼠随机分为Model组9只，BSHX组10只，Captopril组10只。每组灌胃剂量为3 mL·（2次）-1·天-1，Sham组和Model组予等容积去离子水灌胃。BSHX组给予补肾活血复方，剂量为9.2g·kg-1·d-1（因本课题前期实验已经探究出此剂量的中药制剂治疗CHF效果最佳，故使用此剂量）。Captopril组给予卡托普利片配置成的混悬液灌胃，剂量为12.5 mg·kg-1·d-1。以上4组均连续用药或蒸馏水4周。

2.3 标本采集

2.3.1 超声检测大鼠心功能 各组大鼠用药或去离子水28d后行心脏超声检测。将大鼠麻醉固定后，用超声机的探头置于大鼠心前区，测出LVDD和LVDS值并算出EF和FS值。

2.3.2 Wb法检测心、肾组织中klotho及Col 1a1蛋白的表达 所有大鼠处死后立即取出200μg心肌及100μg肾组织，将其充分剪碎后加入RⅠPA裂解液，从中提取蛋白，电泳后将蛋白转移到膜上。漂洗后封闭1h，洗膜3次；洗涤后加入分别加入klotho及Col 1a1一抗稀释液，4℃孵育过夜后洗膜3次；加入二抗稀释液后重复以上步骤，最后通过ECL观察并分析结果。

2.3.3 心肌细胞形态观察 将每组大鼠的心肌组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋切片、脱蜡、HE染色等步骤，镜下观察心肌细胞的形态变化。

3 统计学方法

应用SPSS20.0统计学软件进行分析，数据都表示为均数±标准差（±s），采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，结果中P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 补肾活血复方对大鼠心脏超声的影响

与Model组 比 较，Sham组 大 鼠LVDD、LVSD、EF、FS有显著性差异（P＜0.05）。BSHX组和Captopril组经治疗后，LVDD、LVSD、FS均有显著改善，EF值高于Model组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1，图3、4。

图3 Sham组大鼠常规喂养4周后心脏彩超

表1 BSHX对大鼠心脏超声的影响（±s）

表1 BSHX对大鼠心脏超声的影响（±s）

注：与Sham组比较aP＜0.05；与Model组比较bP＜0.05。

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3.2 补肾活血复方对大鼠心、肾组织中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表达的影响 与Sham组相比，Model组心、肾组织中klotho蛋白含量减少，心肌中Col 1a1蛋白含量增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Model组比较，BSHX组和Captopril组心、肾组织中klotho蛋白含量增多，心肌中Col 1a1蛋白含量减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2，图5。

图5 大鼠心、肾组织中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白的表达

表2 BSHX对大鼠心、肾组织中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表达的影响（±s）

表2 BSHX对大鼠心、肾组织中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表达的影响（±s）

注：与Sham组相比aP＜0.05；与Model组相比bP＜0.05。

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图4 Model组大鼠常规喂养4周后心脏彩超

3.3 补肾活血复方对大鼠心肌细胞纤维化的结果在HE染色中显示，Sham组心肌细胞排列整齐，纤维走行正常。但Model组心肌纤维走行混乱，纤维断裂、缺失，表明心肌严重损伤；BSHX组和Captopril组缓解了以上的症状，走行逐渐有序，纤维重组。见图6。

图6 大鼠心肌细胞形态

讨 论

在实验中我们采用左冠状动脉前降支结扎术，因为此结扎术实验操作复杂，手术要求较高，但展现的结果与人类的心肌纤维化最相似，是现在较为公认的CHF模型[10]，本课题增加了配合力竭式运动，加重了心衰程度，并加快了病程发展，经心电图可以看到ST段明显抬高，并且观察到大鼠活动状态变差，甚至伴有明显的哮鸣音，判断成功给大鼠建立了CHF模型。在我们课题的前期研究中也证实，补肾活血复方可以通过上调心、肾中klotho蛋白的表达，达到阻止心衰发展的目的[11]，所以此次实验加用了wb法检测ColⅠ蛋白，来进一步观察心肌纤维化的程度，并联系“肾藏精起亟”理论进一步理解补肾活血复方在慢性心衰中的治疗思路，为中西医在治疗CHF上提供新的治疗靶点。

心脏纤维化定义为细胞外基质（ECM）产生和降解的失衡，从而在许多心脏病理生理状况中导致心脏功能障碍[12]。CHF引起了异常的容量和压力负荷，导致了心肌细胞长期缺血，发生了顺应性改变，还有研究证明心肌纤维化会加重心力衰竭的程度[13-14]，所以改善心肌细胞纤维化对CHF患者预后的关键一步。而心肌纤维化是由成纤维细胞对纤维胶原蛋白转换的调节改变而引起的，这促进了心肌间质内和心肌内血管周围的Ⅰ型胶原蛋白（Col 1a1）纤维的过度沉积[15]。

Klotho基因（又称α-klotho）首次被Kuroo， M.等人（1997）确定为小鼠抗衰老基因[16]。但其实Klotho家族是由α-klotho、β-klotho和γ-klotho三类基因组成，其中α-klotho和β-klotho基因都编码膜结合蛋白和分泌蛋白[17]，本文章内所研究的klotho即为α-klotho。大量先前的研究已经表明，klotho基因参与了发生与多种人类疾病的发展，包括慢性肾脏疾病、动脉硬化症、心肌肥大、糖尿病和肥胖、以及各种类型的癌症[18]。LV等[19]研究发现Klotho是一种具有肾脏和心脏保护作用的抗衰老蛋白，Klotho过表达可通过灭活NF-kB通路减轻心衰和肾损伤。Chen等[20]则认为分泌的Klotho通过激活Nrf2促进谷胱甘肽还原酶（GR）的表达，GR心脏特异性过表达减弱了心肌纤维化。已有实验证明在慢性心衰大鼠中，Klotho mRNA的表达与Col 1a1 mRNA的表达存在负相关的关系，两者可能存在互相调节的关系[21]。Klotho通过减少TGF-β1的数量，间接抑制microRNA-132的表达[22]，它抑制atrogin-1表达所必需的转录因子FOXO3。这个F-box蛋白激活了心肌细胞钙调神经磷酸酶的泛素化和降解，而过量的钙调神经磷酸酶刺激NFAT，激活了NFAT的下游基因促纤维化基因的表达。因此，klotho通过抑制microRNA-132来限制心肌纤维化的发展[23]。

中医认为CHF属于“胸痹”“心悸”“怔忡”等范畴，临床中常有胸痛、胸闷、气短、心悸、下肢浮肿等临床表现[24-25]。张艳教授提出了“肾藏精起亟”理论治疗CHF，《中医基础理论》中也提到，“精”是人体的原始物质，是生命活动的本原。同时在《素问·六节藏象论》中也提及：“肾者， 主蛰， 封藏之本， 精之处也。”充分说明了肾对精的蛰伏和闭藏作用。程士德：“亟，急也。又频数也。”在古，极通亟，如今部分学者认为“起亟”即为应付各种紧急或极端的变化，应激反应时人体会分泌大量的肾上腺皮质激素来应对紧急情况[26]。肾精亏虚时，一方面血化失源，心主身之血脉，化赤行血；另一方面无以生血，心血不足，心脉失于濡养，出现心悸、胸痛、气短等症状。王长江等[27]人从“肾藏精”角度论证了Klotho基因的表达与肾精的兴衰成相关性，认为Klotho是肾精的组成部分。张艳教授正是从补肾益精、活血利水的治疗原则出发，拟出补肾活血复方，方中以人参、黄芪为君药，正反、阴阳互用，共奏扶正、补血、行气之功；丹参、红花、三七为臣，活血化瘀；菟丝子、黄精补益肾精；益母草活血利尿。

综上所述，治疗心肌纤维化对慢性心力衰竭患者是极其关键的一步，在西医上主要是运用沙坦类、他汀类等降压降脂方式来缓解纤维化程度，并没有公认的抗纤维化的药物。对比之下，补肾活血复方提高了klotho蛋白的表达，同时降低了心肌纤维化的程度，以达到改善CHF的目的，但具体机制还需要进一步研究。