贾跃进常用治疗失眠障碍药对的作用机制分析*

彭雪峰，刘毅，赵飞，王瑞敏，张译心，李菲，陈艳清，贾跃进

1 山西中医药大学 山西太原 030024

2 山西中医药大学附属医院 山西太原 030024

失眠障碍（Ⅰnsomnia Disorder，ⅠD）是最常见的一种疾病，其表现以入睡困难、频繁觉醒或无法再眠，并且伴随日间功能障碍为特征，是许多精神、躯体疾病的危险因素。[1-2]但鉴于目前西药的治疗中存在一些令人担忧的副作用和安全隐患，而中药则相对副作用小，疗效明显，存在一定优势[1-3]。因此挖掘中药可对失眠症的药物治疗提供思路和参考。

贾跃进主任医师是第六批全国老中医药专家学术经验继承工作室指导老师，临证40余年，尤擅应用中药治疗包括失眠症在内的多种神经、精神疾病。曾师从国医大师吕景山，继承其对药调治疾病的学术思想，临床用药往往在辨证论治的基础上，活用对药治疗各种疾病，常以菖蒲-郁金（CP-YJ）、丹参-元胡（DS-YH）、黄连-栀子（HL-ZZ）、酸枣仁-柏子仁（SZR-BZR）、百合-地黄（BH-DH）5个药对配合使用治疗失眠症，取得了较好的疗效。故本文根据中药多成分、多靶点、多通路的复杂网络特性选取网络药理学方法研究该5个药对，以期为临床使用及进一步研究提供一定思路。

资料与方法

1 各药对活性成分与靶点搜集

利 用TCMSP数 据 库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）（检索关键词：Herb Name分别是：郁金、丹参、元胡、黄连、栀子、酸枣仁、柏子仁、百合、地黄）检索所有药对中药物的活性成分，按照OB（oral bioavailability）≥30%，BBB（blood brain barrier）≥-0.3，DL（drug—likeness）≥0.18进行筛选，并根据中国知网（https：//www.cnki.net/）相关药物文献（检索关键词为：SU=菖蒲 OR 化学成分）最终确定药物中确有作用的活性成分，然后结合TCMSP与Swisstargetprediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）得出药物各活性成分的作用靶点，在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）中匹配基因名。

2 疾病靶点与药对-疾病交集靶点搜集

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMⅠM（https：//omim.org/#）数据库中检索“insomnia disorder”以搜集疾病靶点，筛选后匹配Uniprot数据库中的基因名。然后利用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）确定各药对与疾病的交集靶点，并绘制Venn图。

3 疾病-药对-药物-成分-靶点网络和蛋白互作关系（PPⅠ）网络构建

以疾病、药对、药物、活性成分和靶点为节点，其相互关系为边，在CytoscapeV3.6.1中构建网络。同时将5个药对与疾病的交集靶点分别导入String数据库（https：//string-db.org/）限定物种为智人，并利用Cytoscape软件构建PPⅠ网络，利用内置MCODE插件及网络分析功能限定节点度值筛选PPⅠ网络核心靶点。

4 GO（Gene Ontology）富 集 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

在Metascape（https：//metascape.org/）数据库平台中导入1.2中5类交集靶点并分别进行GO生物过程、分子功能及细胞成分富集分析和KEGG通路富集分析，然后利用在线作图平台微生信平台及ⅠmageGP（http：//www.ehbio.com/ⅠmageGP/）绘制GO富集条形图及KEGG通路富集气泡图。

5 核心成分和核心靶点分子对接验证

取疾病-药对-药物-成分-靶点网络中节点度＞2倍中位数的核心有效成分和核心PPⅠ网络中节点度大于中位数的核心靶点，利用PDB（http：//www.rcsb.org/）及Zinc（http：//zinc.docking.org/）数据库分别获得核心靶点和核心成分的3D结构，预处理后应用Autodock vina分子对接，并在Pymol中可视化结果。

结 果

1 药对活性成分、相关靶点搜集结果

通过检索TCMSP数据库、查阅中国知网，并限定OB、BBB、DL值筛选活性成分，其结果如表1所示。其中菖蒲-郁金、丹参-元胡、黄连-栀子、酸枣仁-柏子仁、百合-地黄活性成分各13、93、24、17、10种，而5个药对分别匹配得相关靶点各：351、230、176、166、166个。

表1 各药对主要活性成分基本信息

2 疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集结果

在GeneCards、OMⅠM数据库中检索失眠症靶点，将其合并去重后，共得到失眠症靶点994个。将1.1中5个药对靶点分别与其取交集，如图1，得到交集靶点分别：89、67、49、44、52个。

图1 药对-疾病交集靶点

3 疾病-药对-药物-成分-靶点网络和PPⅠ网络构建结果

疾病-药对-药物-成分-靶点网络构建结果如图2所示，图中包含772个节点，3167条边。利用Cytoscape分析网络，计算节点度，筛选网络中节点度＞2倍中位数的核心成分。然后将2.2中药对-疾病交集靶点分别导入String数据库，得出以靶点为节点，蛋白相互作用为边的5个网络，并利用Cytoscape内置的MCODE插件以及网络分析功能筛选各网络中的核心网络以及节点度大于中位数的核心靶点，核心网络见图3。最后得到菖蒲-郁金药对核心成分为：CP4、CP3、YJ3、YJ4、YJ6、YJ7及A，核心靶点为：DRD2、HTR2C、OPRM1、DRD4、ADRA1A、HTR5A；丹参-元胡药对核心成分为：DS6、DS42、DS43、D、H，核心靶点为：DRD2、FOS、SLC6A4、MAOA、CRH、ACHE、HTR3A；黄连-栀 子的 核 心 成 分为：ZZ1、ZZ6、A、D、H，核心靶点为：FOS、VEGFA、ⅠL6、ⅠL1B、MMP2、MMP9；酸枣仁-柏子仁的核心成分为：SZR5、BZR1，核 心 靶 点 为：ADRA1A、APP、GRM5、CASR；百合-地黄的核心成分为：BH3、A、D，核心靶点为：OPRM1、ADRA1A、APP、ADRA2A、ADRA2C、F2。

图2 疾病-药对-药物-成分-靶点网络

图3 PPⅠ网络图

4 GO富集分析和KEGG通路富集分析结果

将疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集结果中所得5类交集靶点导入Metascape进行GO和KEGG通路富集分析，其中菖蒲-郁金—失眠症的GO富集分析共得1296条结果，包括突触信号、调节神经递质水平、节律过程、GABA能的突触传递等生物过程，神经递质受体活性、G蛋白偶联的胺受体活性、激素结合等细胞功能，以及枝晶、突触膜、膜筏等细胞成分，此外KEGG通路富集分析获得89条通路，包括：神经活性配体-受体相互作用、多巴胺能突触、血清素能突触、昼夜节律等通路；丹参-元胡—失眠症的GO富集分析共得1062条结果，包括行为、化学突触传递、调节神经递质水平、单胺运输、GABA能的突触传递等生物过程，神经递质受体活性、肾上腺素受体活性、类固醇结合等分子功能，以及突触膜、GABA-A受体复合物、轴突等细胞成分，此外KEGG通路富集分析获得49条通路，包括：神经活性配体-受体相互作用、多巴胺能突触、血清素能突触等通路；黄连-栀子—失眠症的GO富集分析共得828条结果，包括循环系统中的血管过程、化学突触传递、调节神经递质水平等生物过程，肾上腺素受体活性，神经递质受体活性、类固醇结合等分子功能，以及突触前膜、膜筏等细胞成分，此外KEGG通路富集分析获得63条通路，包括神经活性配体-受体相互作用、TNF信号通路、多巴胺能突触等通路；酸枣仁-柏子仁—失眠症的GO富集分析共得690条结果，包括行为、MAPK级联反应的调控、单胺运输等生物过程，肾上腺素受体活性、单胺跨膜转运蛋白活性、神经递质受体活性等分子功能，以及膜筏、突触后膜的组成部分等细胞成分，此外KEGG通路富集分析获得38条通路，包括：神经活性配体-受体相互作用、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、血清素能突触等通路；百合-地黄—失眠症的GO富集分析共得755条结果，包括行为、细胞分泌调节、昼夜节律的调节等生物过程，神经递质受体活性、肾上腺素受体活性等分子功能，以及突触后膜、GABA-A受体复合物等细胞成分，此外KEGG通路富集分析获得41条通路，包括：神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触等通路。然后筛选p值＜0.01，最小计数为3，富集因子＞1.5的富集项，分别绘制GO富集结果图和KEGG富集气泡图，如图4、5。然后分别以交集靶点、通路、疾病及各药对为节点，其相互关系为边构建网络，以直观表明四者关联，如图6，其中神经活性配体-受体相互作用通路的基因比、基因计数及q值都较大程度比其他通路高，因此可认为该5对药对均最可能藉由此通路对失眠症作用。

图4 GO富集分析结果

图6 疾病-靶点-通路关系图

5 核心成分与核心靶点分子对接结果

疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集结果中筛选得到的核心成分与核心靶点对接结果皆小于-5 kcal·mol-1，可见所有核心成分与核心靶点的组合都可形成稳定结构，结果如表2。再取与每个药对对接最稳定的组合运用Pymol对其构象可视化，其中灰色部分为靶点，绿色部分为成分分子，其余各色标记残基，并显示名称，黄色虚线为氢键，并标距离，见图7。

表2 核心活性成分与核心靶点分子对接结果

图7 对接较好的核心成分与核心靶点的分子对接构象

讨 论

失眠症，中医称之为“不寐”。《灵枢》云：“夫卫气者，昼日常行于阳，夜行于阴，故阳气尽则卧，阴气尽则窹”。[4]确立了“阳不入阴，阴阳失交”的总病机，贾跃进老中医结合其总病机以及朱丹溪的“六郁”学说，从而认为气、血、痰、火、湿、食等“郁”壅塞气道，阻遏气机，以致营卫失合，阳不入阴，则发为不寐，并将“调气”作为治疗不寐的大法，并常以化痰安神的菖蒲-郁金、活血安神的丹参-元胡、清心安神的黄连-栀子、养血安神的酸枣仁-柏子仁、养阴安神的百合-地黄配合疏肝行气解郁的方剂从“郁”论治不寐。现代药理学研究亦表明这些药物均可在抗抑郁、抗焦虑、镇静催眠、脑保护等方面发挥作用[5-11]。所以该5个药对从中医理论和现代研究来看，确可治疗失眠症。而在贾师实际应用中亦效如桴鼓，切有较多的验案与经验类文献对其疗效与应用进行了报道[12]。

图5 KEGG通路富集分析气泡图

根据本文构建的疾病-药对-药物-成分-靶点网络所得的核心活性成分来看，CP3、CP4是来自CP中的挥发油类，对其大量研究证实其存在抗焦虑、抗抑郁、抗癫痫、神经保护等广泛神经系统作用，动物实验亦证实其可增加γ-氨基丁酸（GABA）受体阳性变构调节剂诱导的小鼠睡眠时间[13]；YJ3、YJ4、YJ6、YJ7属于郁金的挥发油成分，该类成分在动物实验中被报道可显著改善小鼠的工作记忆和空间学习记忆能力[14]；DS6可以通过激活ERK和GSK-3β信号来减轻低胆碱能神经传递引起的认知障碍[15]；DS43是DS中的三萜类物质，其被报道具有多方面的神经保护作用，如可通过p-p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和血管内皮生长因子（VEGF）减弱新生大鼠的神经炎症，以及抑制小胶质细胞活化和减少NADPH氧化酶和iNOS的表达来发挥神经保护作用[16-17]；ZZ1是一种五环三萜，被认为在中枢神经系统（CNS）的一些疾病中具有治疗潜力，包括：认知障碍、抑郁、焦虑等[18]；ZZ6则被认为存在抗炎的作用，而其作用可能与组胺，5-羟色胺（5-HT），激肽和前列腺素的释放有关[19]；SZR5是酸枣仁的主要活性成分，可调节GABA受体亚基mRNA的表达，下调肠粘膜系统相关炎症细胞因子的分泌，而影响大脑神经细胞之间的细胞间细胞因子网络以发挥其镇静催眠作用[20]；BZR1属于花生酸，该物质在神经系统中有重要作用，包括睡眠诱导，增强空间学习和突触可塑性以及抗炎和神经保护等[21]；D、A、H是药物共有的成分，可见药对之间存在一定的协同作用，其中成分D在动物实验中被验证可上调谷胱甘肽、GABA水平，下调多巴胺（DA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、乙酰胆碱酯酶（AChE）等的水平调节精神症状、改善脑功能[22]；成分A则可抑制TNF-α而发挥神经保护作用，而动物实验亦验证其可增加小鼠CNS中的去甲肾上腺素（NE），5-HT等神经递质而表现抗抑郁活性[23-24]。

通过PPⅠ网络得出的核心靶点，其中OPRM1、DRD2、DRD4、ADRA1A、ADRA2A、ADRA2C、HTR3A、HTR5A、HTR2C、SLC6A4、MAOA、ACHE、CRH编码的蛋白参与调控涉及E、NE、DA、5-HT、ACh等神经递质，而这些神经递质是已知的调控睡眠-觉醒的关键物质[25]；ⅠL6、ⅠL1B所编码的蛋白则参免疫调节，其中促炎性细胞因子ⅠL-1，ⅠL-6会增加非快速眼动睡眠，而消炎性细胞因子ⅠL-4、ⅠL-10会降低睡眠时间[26]；MMP2、MMP9编码基质金属蛋白酶，这类蛋白酶已被证明在大脑的许多生理和病理过程中起着至关重要的作用，特别是在一些学习和记忆过程及主要的神经精神疾病中，例如精神分裂症，癫痫症和抑郁症等[27]；VEGFA在研究中被表明可影响GABA能神经元的发育[28]；FOS则被认为与觉醒相关[29]；APP在睡眠中断时会增加表达，从而增加阿尔茨海默症的风险[30]；GRM5编码谷氨酸的G蛋白偶联受体，在调节突触可塑性和调节神经网络活动中起重要作用[31]。

总体来看GO富集分析所获得的主要生物过程与KEGG通路富集分析得到的主要通路都分别集中在调节神经递质水平、化学突触传递、行为、昼夜节律调节等生物过程以及神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、多巴胺能突触、胆碱能突触等通路，可以看出这些药对的主要机制应是通过DA、5-HT、ACh等神经递质调节的，与目前睡眠的神经生理机制相吻合。而就分子对接结果来看，所有核心成分与核心靶点均能形成稳定结构，可一定程度验证网络药理学结果。

综上所述，根据中医理论、网络药理学研究及分子对接验证，可初步揭示贾跃进老中医治疗失眠症的常用药对的核心成分和核心靶点以及其主要作用机制，所得结论可为进一步研究和临床的使用提供一定参考和依据。