基于HPLC法检测芍药根中芦丁含量

张 杰，吴 昊

安徽道源堂中药饮片有限公司，安徽涡阳，233600

芍药(RadixPaeoniaeAlba.)是毛茛科植物芍药科、芍药属的多年生草本植物[1]。根粗壮，分枝黑褐色，为中国传统中药，主要分布于安徽、浙江、四川等地[2]。其用药历史悠久，现存最早的药学专著《神农本草经》便有收载[3]。白芍具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效[4-6]。白芍的化学成分主要为单萜及其苷类[7]、三萜类、芳香酸及其黄酮及其苷类、鞣质类、多糖类、挥发油等[8]。有研究表明芍药具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、镇痛、抗癌、抗抑郁和抗肝纤维化[9]等，具有保肝、抗炎、抗风湿、调节免疫功能等药理作用[10-14]。黄酮类成分有丰富的药理活性，具有抗肿瘤、镇痛作用，对心脑缺血损伤、心律失常等也有一定的保护。近年来，对芍药的研究工作，取得了许多成果[15-16]，但对芍药花中生物活性成分提取条件的优化以及芍药根中黄酮类物质的测定缺少系统性研究[17]。综上所述，本研究以HPLC检测芍药根中芦丁的含量，旨在建立芍药质量检测方法标准，为芍药资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品采集于亳州当地种植的芍药，并经安徽中医药大学鉴定，洗净后干燥处理。用粉碎机粉碎，过80目筛后于磨口瓶中低温保存。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪(SPD-20A型，日本岛津仪器有限公司)，超纯水机(Direct-Q3型，美国Millipore公司)，色谱柱(C-8型，日本岛津仪器有限公司)，粉碎机(9FZ-360型，郑州中远机械设备有限公司)，抽滤装置(JC-CHL-12型，天津Do-Chrom Technology公司)，电子天平(JA2603B型，上海精科天美科学仪器有限公司)。

乙腈(色谱纯)，上海吉至生化科技有限公司；冰乙酸(分析纯)、甲醇(分析纯)，天津同新化工有限公司；芦丁(rutin)标准品，合肥博美生物科技有限责任公司。

2 实验方法

2.1 样品溶液的制备

取芍药根粉末，精确称取5.00 g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶20加入超纯水，持续加热3 h。冷却抽滤，将所得样品溶液过0.45 μm滤膜即得检测样液。

2.2 芦丁标准品溶液的制备

精密称取芦丁41.4 mg于试管中，加入10 mL甲醇，得到浓度为4.14 mg·mL-1的储备液。取标准品储备液1 mL定容到10 mL，过0.45 μm微孔滤膜即得浓度为414 μg·mL-1标准品溶液。

2.3 色谱条件

采用shim-pack C18色谱柱，以乙腈为有机相(A),0.5%醋酸(B)为流动相，设置柱温30℃，调整总流速为0.8 mL·min-1；检测波长260 nm；梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC梯度洗脱时间程序

3 实验结果

3.1 方法学考察

3.1.1 线性关系考察

取芦丁标准品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容,制成浓度为0.020 7 mg·mL-1、0.041 4 mg·mL-1、0.082 8 mg·mL-1、0.165 6 mg·mL-1、0.207 0 mg·mL-1、0.414 0 mg·mL-1系列梯度溶液。按照“2.3”设定的色谱条件进样20 μL，重复3次，记录出峰时间以及峰面积(图1)。取峰面积作纵坐标，芦丁浓度作横坐标，绘制标准曲线回归方程Y=35 838x+169 006，相关系数R=0.998 9，线性范围为2.07～414 μg·mL-1。结果表明,芦丁浓度与峰面积具有良好的线性关系,见图2。

图1 芦丁标准品(A)和样品(B)HPLC色谱图

图2 芦丁标准品标准曲线

3.1.2 精密度试验

取“2.2”配制的芦丁标准品溶液20 uL，按“2.3”设定的色谱条件进行连续重复实验6次，测得芦丁标准品峰面积，计算其相对标准偏差(RSD)为1.45%，明显小于2%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 稳定性

取芍药根粉末，按照“2.1”项制备供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分别取样，按“2.3”项色谱条件测定重复进样测定上述样品6次。结果显示,样品中芦丁峰面积的RSD为1.1%，明显小于2.0%，结果显示本方法的稳定性较好。

3.1.4 重复性

取芍药根粉末，按照“2.1”方法制备6份供试样品溶液，并以“2.3”设定的实验条件进行测定，重复6次。结果表明芦丁峰面积的RSD为1.65%，也小于2.0%，表明本方法的重复性良好。

3.1.5 加样回收率

精密称取芍药根粉末样品5.00 g，按照“2.1”项方法制备样品溶液，精密加入适量芦丁标准品，计算相应的回收率，结果见表2。

表2 芦丁加样回收率

3.2 含量测定

精密称取芍药根粉样品，按“2.1”项方法制备供试品溶液，进样上述溶液20 μL记录色谱图统计峰面积(图2B)，重复3次。根据标准品的标准曲线，计算芍药样品中所含芦丁的含量，见表3。

表3 芍药根样品中芦丁含量

4 讨 论

芍药作为中国传统中药，最早记载于古籍《神农本草经》中[4]。中医指出芍药具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效。芦丁作为芍药中黄酮类物质，不仅具有多种生物学活性，如调节毛细血管渗透性、降血脂、保护细胞和抗痉挛等生物学作用，而且还有多种药理活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒，预防和治疗心血管疾病、糖尿病，同时还有抗癌、神经保护等药理作用[18]。本研究以传统中药煎煮方法为背景，按料液比1∶20回流提取3 h。以乙腈醋酸水为流动相，采用shim-pack C18色谱柱，设置柱温30 ℃，调整总流速为0.8 mL·min-1；检测波长260 nm。检测结果表明芦丁在芍药根药材中含量为8.58 μg·mL-1。对中草药黄酮类成分研究具有重要意义。

综上所述，本研究建立HPLC法，测定白芍中芦丁成分的含量，初步对白芍的质量进行考察，方法简单，结果可靠，重复性好，对白芍整体质量控制评价体系的建立提供了实验基础。