盘龙七片缓解关节炎软骨细胞损伤和炎症反应

宋启春,赵 研,李 东,宋继东,樊立宏,时志斌

(西安交通大学第二附属医院骨一科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:zhibin-shi@126.com)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见慢性关节退行性疾病,多发生于老年人,表现为关节软骨破坏、关节边缘骨质增生及软骨下骨硬化[1-3]。流行病学研究显示,骨关节炎是导致下肢残疾的十大常见病因之一,发病率逐年提高,严重影响患者的生活质量[4]。软骨细胞炎症和细胞基质丢失一直被认为是加重骨关节炎进程的重要病因之一[5]。

盘龙七片是由著名老中医王家成所献祖传秘方,经科学研制而成的中成药,临床应用表明其对骨关节炎病症具有显著疗效[6,7]。然而关于盘龙七片对骨关节炎软骨细胞损伤的保护作用及其相关机制的研究仍然极为有限。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作为一类异质性非编码RNA,其基因组的数量在发育和分化过程中显著增加,证明lncRNA在基因表达调控中起着至关重要的作用[8]。有研究表明,lncRNA前列腺癌相关转录本1(prostate cancer-asso-ciated transcript 1,PCAT-1)在关节炎软骨细胞中被显著上调;在分离培养的人关节炎软骨细胞中下调PCAT-1可显著抑制细胞凋亡[9]。目前为止,没有报道表明盘龙七片是否可通过PCAT-1缓解关节炎软骨细胞的损伤及炎症反应。本研究通过分离培养骨关节炎软骨细胞,探究盘龙七片对其保护作用及作用机制,为解析盘龙七片治疗骨关节炎的药理机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

ACAN兔单抗、COL2A1兔单抗、MMP-13单抗、Caspase-3兔单抗、GAPDH兔多抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自英国Abcam公司;BCA试剂盒购自美国Pierce公司;TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自美国Cell Singnal Technology公司;SuperScriptTMPreamplification System for First Strand cDNA Synthesis试剂盒购自美国Gibco公司;pDNA3.1-PCAT-1购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 骨性关节炎模型的建立

8周龄雄性SD大鼠45只,体质量280-320 g,采购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,2%水合氯醛0.2 ml/10 g腹腔内注射麻醉小鼠,夹尾无反应后,曲屈大鼠膝关节,于关节两侧进针。在1,4,7 d,分别将0.2 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液注射到膝关节腔内(刺破关节腔时有突破感,注射药物时无阻力)。随后进行膝关节Lequesne MG评估级别,平均评分>40说明大鼠膝关节骨性关节炎模型建立成功。

1.3 骨关节炎软骨细胞分离、培养及分组

脱颈法处死关节炎模型大鼠,75%乙醇内浸泡消毒15 min,PBS清洗,分离大鼠四肢并放入D-Hanks液内,分离并剥离大鼠关节软骨组织,剪切组织小块(1 mm3),转移至离心管内(15 ml),用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 ℃消化30 min,37 ℃条件下用2 mg/ml Ⅱ型胶原酶消化4 h,以1 000 r/min离心收集底层软骨细胞,加入含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞,37 ℃、5%CO2培养,每2 d更换1次培养基,使用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验分组如下:对照组(正常培养的骨关节炎软骨细胞),30,60,90,120 μg/ml组(30,60,90,120 μg/ml盘龙七片处理24 h的骨关节炎软骨细胞),盘龙七片+PCAT-1组(转染pcDNA3.1-PCAT-1后60 μg/ml盘龙七片处理24 h的骨关节炎软骨细胞),盘龙七片+pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1后60 μg/ml盘龙七片处理24 h的骨关节炎软骨细胞)。

1.4 骨关节炎软骨细胞凋亡检测

采用TUNEL法测定对照组、30 μg/ml组、60 μg/ml组、90 μg/ml组、120 μg/ml组的细胞凋亡。吸弃细胞的培养基,PBS洗涤3次,加入1 ml 4%的多聚甲醛,固定细胞20 min,用PBS清洗3次,按照说明书配制TUNEL检测液,每个样品中加入50 μl TUNEL检测液,37 ℃孵育60 min,而后用PBS清洗2次,每次3 min。用荧光淬灭封片液封片,荧光显微镜下观察拍照。

1.5 骨关节炎软骨细胞DNA含量检测

对照组、30 μg/ml组、60 μg/ml组、90 μg/ml组、120 μg/ml组爬片处理后,PBS洗涤2次,加500 μl蛋白酶K溶液,置于56 ℃环境下6 h,加入1 μl Hoechst 33258,室温下避光反应30 min,在荧光酶标仪上,检测460 nm处上清液的吸光度值。以小牛胸腺DNA为标准曲线,计算出各组样本中DNA含量。

1.6 骨关节炎软骨细胞增殖检测

CCK-8法测定对照组、30 μg/ml组、60 μg/ml组、90 μg/ml组、120 μg/ml组、盘龙七片+PCAT-1组和盘龙七片+pcDNA3.1组细胞增殖。取培养后第3-5代软骨细胞,以1×104/孔的密度接种于96孔板,37 ℃、5%CO2培养24 h,待其细胞贴壁后分别加入不同浓度盘龙七片或细胞转染,继续培养24 h,PBS清洗,每孔加入10 μl CCK-8试剂继续孵育2 h。酶标仪测定各孔490 nm波长处吸光度值,每组3个复孔取平均值。

1.7 骨关节炎软骨细胞炎症因子检测

ELISA试剂盒检测对照组、30 μg/ml组、60 μg/ml组、90 μg/ml组、120 μg/ml组、盘龙七片+PCAT-1组和盘龙七片+pcDNA3.1组IL-1β和TNF-α水平。收集各组细胞,以12 000 r/min 4 ℃离心20 min,取上清液,按照ELISA试剂盒说明书进行检测,首先样品加入反应孔后37 ℃孵育45 min,洗涤液洗涤后加入生物素标记的抗体37 ℃反应30 min。然后加链霉亲和素-HRP混匀37 ℃反应30 min,再加入显色剂避光显色15 min。最后加终止液终止反应,用酶标仪检测450 nm处吸光度值,计算各因子含量。

1.8 RT-qPCR检测骨关节炎软骨细胞中PCAT-1含量检测

按照Trizol说明书提取对照组和60 μg/ml组细胞总RNA,采用SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis试剂盒合成cDNA。按照TaKaRa荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系,以GAPDH为内参进行PCR扩增,每个样品重复3次,循环条件为95 ℃ 30 s,60 ℃30 s;72 ℃30 s,共40个循环;60 ℃延长5 min。PCAT-1上游引物:5′-AAT GGC ATG AAC CTG GGA GGC G-3′,下游引物:5′-GGC TTT GGG AAG TGC TTT GGA G-3′;GAPDH上游引物:5′-ACT GGC GTC TTC ACC3′,下游引物:5′-CGA ACA TGG GGG CAT-3′。2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.9 骨关节炎软骨细胞中蛋白含量检测

采用Western blot方法检测对照组、30 μg/ml组、60 μg/ml组、90 μg/ml组、120 μg/ml组、盘龙七片+PCAT-1组和盘龙七片+pcDNA3.1组中蛋白含量。收集各组细胞,加入RIPA裂解液,在冰上裂解15 min,以12 000 r/min 4 ℃离心30 min,弃去上清液。蛋白质样品经10% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h,PBS洗去封闭液,加一抗:ACAN、COL2A1、MMP-13、Caspase-3或GAPDH兔多克隆抗体(均为1 ∶800),4 ℃孵育过夜。PBS清洗膜,加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,室温孵育1 h,加入ECL发光液避光显影于凝胶成像仪曝光拍照。GAPDH为内参对照蛋白。

1.10 pDNA3.1-PCAT-1转染骨关节炎软骨细胞

将骨关节炎软骨细胞接种于96孔板,37 ℃,5%CO2条件下培养12 h,待细胞融合达到80%,按照转染试剂Turbofect操作说明进行细胞转染实验。将0.3 μg pDNA3.1-PCAT-1或pDNA3.1分别与0.6 μl Turbofect混匀,而后转染进入于96孔板中培养的细胞,37 ℃,5% CO2孵育24 h用60 μg/ml盘龙七片处理24 h。采用RT-qPCR方法检测转染效率。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 盘龙七片促进骨关节炎软骨细胞增殖

结果表明,与对照组比较,30 μg/ml盘龙七片对骨关节炎软骨细胞增殖无明显的作用,60,90,120 μg/ml盘龙七片均可显著促进骨关节炎软骨细胞增殖(P<0.05,见图1)。另外DNA含量检测同样显示30 μg/ml组中DNA含量较对照组无明显变化。60,90,120 μg/ml组DNA含量较对照组均有显著上升(P<0.05,见图1)。

2.2 盘龙七片抑制骨关节炎软骨细胞凋亡

TUNEL实验显示,与对照组比较,30 μg/ml盘龙七片对骨关节炎软骨细胞凋亡没有明显的作用。60,90,120 μg/ml盘龙七片均可显著抑制骨关节炎软骨细胞凋亡(P<0.05,见图2)。Caspase-3活性检测中,与对照组比较,30 μg/ml盘龙七片对骨关节炎软骨细胞Caspase-3活性没有明显的作用。60,90,120 μg/ml组较对照组可显著抑制骨关节炎软骨细胞Caspase-3活性(P<0.05,见图2)。

2.3 盘龙七片对骨关节炎软骨细胞细胞外基质合成及降解的作用

与对照组比较,30 μg/ml盘龙七片对骨关节炎软骨细胞ACAN、COL2A1和MMP-13蛋白表达量均没有明显的作用。60,90,120 μg/ml组较对照组显著抑制骨关节炎软骨细胞MMP-13蛋白表达量和促进ACAN和COL2A1蛋白表达量(P<0.05,见图3)。

与对照组比较,*P<0.05图1 盘龙七片对骨关节炎软骨细胞增殖和DNA含量的影响Figure 1 Effect of Panlongqi tablets on proliferation and DNA content of osteoarthritis chondrocytes

与对照组比较,*P<0.05图2 盘龙七片对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响Figure 2 Effect of Panlongqi tablets on the apoptosis of osteoarthritis chondrocytes

2.4 盘龙七片抑制骨关节炎软骨细胞炎症相关因子

与对照组比较,30 μg/ml盘龙七片对骨关节炎软骨细胞中IL-1β和TNF-α表达量均没有明显的作用,60,90,120 μg/ml组骨关节炎软骨细胞IL-1β和TNF-α表达量则显著降低(P<0.05,见图4)。综上,本研究选用60 μg/ml盘龙七片进行后续试验。

与对照组比较,*P<0.05图3 盘龙七片对骨关节炎软骨细胞ACAN、COL2A1和MMP-13蛋白表达量的影响Figure 3 Effect of Panlongqi tablets on ACAN, COL2A1 and MMP-13 protein expression in osteoarthritis chondrocytes

与对照组比较,*P<0.05图4 盘龙七片对骨关节炎软骨细胞炎症因子含量的影响Figure 4 Effect of Panlongqi tablets on the content of inflammatory factors in osteoarthritis chondrocytes

2.5 盘龙七片抑制骨关节炎软骨细胞中PCAT-1

结果显示,与对照组比较,60 μg/ml盘龙七片可显著抑制骨关节炎软骨细胞中PCAT-1表达量(P<0.05,见图5)。

2.6 盘龙七片可通过PCAT-1抑制骨关节炎软骨细胞损伤

盘龙七片+PCAT-1组中PCAT-1表达量较盘龙七片+pcDNA3.1组显著升高(P<0.05,见图6),过表达实验成功。与盘龙七片+pcDNA3.1组比较,盘龙七片+PCAT-1组中细胞增殖和ACAN蛋白表达量均显著降低(P<0.05),Caspase-3活性、MMP-13、IL-1β和TNF-α水平均显著升高(P<0.05,见图6)。

与对照组作比较,*P<0.05图5 盘龙七片对骨关节炎软骨细胞中PCAT-1表达量的影响Figure 5 Effect of Panlongqi tablets on the expression of PCAT-1 in osteoarthritis chondrocytes

与60 μg/ml组作比较,*P<0.05图6 盘龙七片可通过PCAT-1抑制骨关节炎软骨细胞损伤Figure 6 Panlongqi tablets inhibits osteoarthritis chondrocyte damage through PCAT-1

3 讨论

关节炎是以关节软骨退变为核心,累及骨质,并包括滑膜、关节囊及关节囊外其他结构的不同程度的炎性病变[10,11],其重要特征是软骨细胞死亡及软骨基质代谢失衡,软骨细胞炎症因子的表达和异常凋亡对关节炎的发生发展至关重要[12,13]。近年来,医药工作者利用中医药手段治疗骨性关节炎等相关疾病,取得了大量研究成果[14]。盘龙七片以盘龙七、竹根七、羊角七、青蛙七、川乌、草乌、当归、杜仲、红花、过山龙、丹参等为主要成分,具有活血、通络、抗炎和祛风湿等药理作用[15]。临床应用表明,盘龙七片对包括骨关节炎在内的不同类型的骨科疾病均具有明显的临床疗效,既往关于盘龙七片治疗骨关节炎的研究主要针对其临床疗效,对其调控骨关节炎软骨细胞的具体机制的研究极为有限[16-18]。因而,探究盘龙七片对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡、炎症和骨基质代谢的作用及机制具有重要意义。ACAN和COL2A1是构成软骨基质的主要成分[19]。IL-1β和TNF-α是重要的炎症因子,可刺激基质金属蛋白酶(MMPs)的合成,而MMPs具有促进软骨基质降解的作用[20,21]。本研究通过建立大鼠膝关节骨性关节炎模型并分离培养骨关节炎软骨细胞,探究盘龙七片对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡、炎症和骨基质代谢的作用。结果表明,30 μg/ml盘龙七片对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡、DNA含量、炎症因子水平(IL-1β和TNF-α)、ACAN、COL2A1、MMP-13和Caspase-3蛋白表达量均无明显作用,我们推测是因为盘龙七片浓度太低,无法发挥作用。与对照组相比,60,90,120 μg/ml组均显著促进骨关节炎软骨细胞增殖、DNA含量、ACAN和COL2A1蛋白表达,同时显著降低骨关节炎软骨细胞凋亡、炎症因子水平(IL-1β和TNF-α)、MMP-13和Caspase-3蛋白表达量;同时,60,90,120 μg/ml三组之间无显著差异。因此,本研究首次揭示盘龙七片(60,90,120 μg/ml)可显著促进体外培养的骨关节炎软骨细胞增殖,抑制其凋亡、炎症反应和细胞基质降解。

近年来研究发现,lncRNA在关节炎软骨细胞增殖、凋亡过程中和维持软骨细胞内环境稳定方面发挥着重要作用[22-24]。研究人员发现敲除lncRNA MFI2-AS1可显著抑制LPS诱导的软骨细胞损伤和软骨基质降解,从而减缓关节炎的疾病进展[25]。Li等[26]干扰LPS诱导的关节软骨细胞中的lncRNA MALAT1后发现,细胞增殖和细胞外基质降低,同时细胞凋亡和炎症因子水平显著升高。最近,Zhou等[9]发现骨关节炎软骨细胞的PCAT-1表达量上升,干扰PCAT-1可显著抑制骨关节炎软骨细胞凋亡,过表达PCAT-1显著促进凋亡。然而还没有文献报道表明盘龙七片是否可以通过PCAT-1调控关节炎软骨细胞损伤。本研究表明盘龙七片(60 μg/ml)显著抑制骨关节炎软骨细胞PCAT-1的表达量,且过表达PCAT-1可明显抵消盘龙七片(60 μg/ml)对关节炎软细胞增殖和ACAN蛋白表达量的促进作用,及对IL-1β和TNF-α水平、Caspase-3和MMP-13蛋白表达量的抑制作用。本研究中过表达PCAT-1对细胞凋亡的作用与Zhou等[9]报道的PCAT-1对关节炎软骨细胞凋亡的作用一致。本研究提示,在骨关节炎软骨细胞中,盘龙七片可能通过下调PCAT-1的表达量,进一步促进骨关节软骨细胞增殖,抑制凋亡、炎症反应和细胞基质降解。

综上所述,盘龙七片可能通过调控PCAT-1对骨关节炎软骨细胞增殖和软骨基质形成具有促进作用,且抑制骨关节炎软骨细胞凋亡和炎症因子生成,进而抑制骨关节炎软骨细胞损伤,为解析盘龙七片治疗骨关节炎的药理机制提供依据。