上皮-间质转化在胰腺纤维化中的作用及大柴胡汤的干预机制

马 莉,段丽芳,许小凡,范建伟,张 红,*

(1陕西中医药大学解剖学教研室,咸阳 712046;2陕西中医药大学病理生理学教研室;3陕西中医药大学医学科研实验中心;4陕西中医药大学解剖学实验中心;*通讯作者,E-mail:zhangh1227@163.com)

在多种器官纤维化的研究中发现,纤维化的进展与EMT相关[1-4]。在EMT过程中,极化良好的上皮细胞失去了顶端-基底极性和稳定的细胞-细胞接触,同时获得了梭形的间充质样细胞表型和产生细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的能力[5]。这些形态学变化与上皮标记物(如E-cadherin、claudins、occludins)的抑制和间叶细胞标记物(如波形蛋白、纤维连接蛋白、N-cadherin)的增加有关[6,7]。

临床和基础研究均发现,慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)病理特征主要是纤维化组织逐渐替代正常胰腺组织[8],纤维的发生与大量胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSC)活化产生ECM有关。近来研究发现体外激活的PSC可通过EMT途径转化为具有产生ECM能力的成纤维细胞[9]。在CP胰腺纤维化进展过程,胰腺组织是否发生EMT目前尚不清楚。临床研究发现大柴胡汤可以减轻CP患者的临床症状,课题组的前期研究也发现大柴胡汤对CP胰腺纤维化有抑制作用[10-14],然而大柴胡汤抗纤维化作用是否与胰腺的EMT有关尚不清楚。本研究拟复制小鼠CP模型观察大柴胡汤对CP胰腺纤维化过程中EMT相关指标的影响,探究大柴胡汤防治CP胰腺纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康昆明(雌雄各半)小鼠,6-8周龄,体质量约16-21 g,购自空军军医大学动物实验中心,许可证书号:0002365。

1.2 药物及试剂

L-arginine(A6969-100G,Sigma公司,美国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(A045-3,南京建成生物研究所);大柴胡汤(陕西咸阳金秋诊所中药制剂室熬制);GAPDH(BM1623,武汉博士德生物工程有限公司);α-SMA(bs-10196R,北京博奥森生物科技有限公司);E-cadherin抗体(AE032517,武汉博士德生物工程有限公司);N-cadherin抗体(AF03317712,武汉博士德生物工程有限公司);浓缩型正常山羊血清(12CO2A09,武汉博士德生物工程有限公司);其他试剂由当地生物制剂公司提供的分析纯化学试剂。

1.3 仪器

Elx808酶标仪,美国伯腾仪器有限公司。Zeiss A1研究级正置数码显微镜,蔡司光学仪器国际贸易有限公司。Western blotting电泳仪器(Bio-Rad电泳转膜系统),美国BIO-RAD公司。化学发光凝胶成像系统(Protein Simple FluorChem FC3),美国ProteinSimple公司。

1.4 实验动物分组及造模

健康昆明(雌雄各半)小鼠78只,6-8周龄,体质量16-21 g,食量无差异、排便均正常。利用随机数字表进行简单随机抽样分为:空白组(n=18,每时间点6只)、CP组(n=30,每时间点10只)和大柴胡汤组(n=30,每时间点10只)。各组小鼠分笼饲养,自由摄取标准饲料,自由饮水,室温饲养。CP组和大柴胡汤组采用腹腔注射20%L-arginine,每周一次,每次两遍,间隔1 h,每遍3 g/kg。空白组腹腔注射等体积的生理盐水。大柴胡汤组在注射L-arginine 1周后,同时给予注射L-arginine和大柴胡汤灌胃治疗5周(14 g/kg,每日一次)。本研究动物实验总时长为6周,从给药开始计时,各组于第2,4,6周麻醉分别处死小鼠,摘取小鼠胰腺组织,通过HE染色观察胰腺组织的病理改变,免疫组化观察胰腺组织中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA的表达变化,Western bloting检测胰腺组织中E-cadherin、N-cadherin蛋白含量的改变。

1.5 标本的采集及处理

在对应时间点分别对各组进行取材。乙醚麻醉,固定于手术板上,75%酒精消毒,完整取出胰腺组织,置于生理盐水中。利用随机数字表进行简单随机抽样分成2份,一份包埋于10%中性甲醛溶液浸泡中固定;另一份迅速放液氮中冷冻,随后转入-80 ℃冰箱保存。

1.6 胰腺组织病理学的观察

已制备好的石蜡切片在65 ℃烘箱内烤片1 h;二甲苯脱蜡、梯度脱水;苏木素浸染2 min;流水洗1 min;1%盐酸酒精分化15 s;流水冲洗1 h;1%伊红浸染2 min;流水冲洗15 min;梯度酒精脱水、二甲苯透明;滴上中性树胶,盖玻片封固。

1.7 免疫组织化学染色观察胰腺组织E-cadherin、N-cadherin及α-SMA的表达

10%甲醛固定胰腺组织,石蜡切片;切片常规脱蜡水化;枸橼酸缓冲液抗原修复;滴加正常山羊血清封闭液,室温静置1 h;加Ⅰ抗(1 ∶200),4 ℃冰箱孵育两夜;复温1 h;TBST洗5次;加Ⅱ抗(1 ∶400),室温孵育1 h;TBST洗5次;滴加试剂SABC,室温40 min;TBST洗3次;DAB显色3-4 min;TBST洗3次;苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。

1.8 Western blotting检测胰腺组织E-cadherin、N-cadherin的蛋白水平

取出冻存胰腺组织,加入蛋白裂解液,匀浆;冰上孵育1 h,期间涡旋振荡2次;4 ℃离心,10 000 r/min,10 min,分装;提取离心上清液,BCA法蛋白定量,加入loading buffer将样品稀释至4 μg/μl,上样至SDS-PAGE,电转移至PVDF膜,封闭1 h;滴加GAPDH抗体(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶200)、N-cadherin(1 ∶200);4 ℃摇床脱色孵育过夜。室温,TBST洗3次;滴加HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1 ∶2 000),室温摇床脱色孵育1.5 h;TBST洗3次;在Protein Simple化学发光成像系统下,选取适当曝光时间并拍照。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 慢性胰腺炎胰腺纤维化过程中EMT的变化

免疫组化结果显示,空白组胰腺组织结构良好,胰腺小叶间无胶原纤维的沉积(见图1)。CP组在第2周,胰腺组织中可见E-cadherin明显表达,随造模时间的延长,E-cadherin表达呈下降趋势;CP组胰腺组织N-cadherin明显表达,并随造模时间的延长,N-cadherin的阳染表达呈上升趋势(见图1)。

图1 E-cadherin与N-cadherin在CP模型的表达 (免疫组化,×400)Figure 1 E-cadherin and N-cadherin expression in CP model (immunohistochemical method,×400)

2.2 大柴胡汤对慢性胰腺炎胰腺纤维化的治疗作用及对EMT的调节

2.2.1 大柴胡汤对慢性胰腺炎模型胰腺病理损伤的影响 HE染色可见,与空白组相比,CP组在第2周,小鼠胰腺组织出现水肿,少量炎细胞浸润,腺泡萎缩及坏死,并可见少量胶原纤维沉积;第4周胰腺损伤持续加重,炎细胞浸润增多,并出现管状化结构,胶原纤维沉积加重;第6周胰腺小叶结构破坏严重,腺泡进一步萎缩,被大量的管状化结构所取代,出现空泡样结构,大量胶原纤维沉积(见图2)。与CP组相比,大柴胡汤组第4周腺泡萎缩,炎细胞及胶原纤维沉积均减少;第6周胰腺组织仅有部分胰腺腺泡细胞出现损伤,胰腺组织中炎细胞浸润、管状化结构及胶原纤维沉积明显减少(见图2)。

图2 大柴胡汤对胰腺病理损伤的影响 (HE,×100)Figure 2 Effect of Dachaihu decoction on pancreatic pathological injury in CP (HE staining,×100)

2.2.2 大柴胡汤对慢性胰腺炎模型胰腺纤维化中α-SMA表达的影响 CP组第2周即可见胰腺组织中α-SMA阳染表达增多,随着纤维化程度的加重,CP组第4,6周小鼠胰腺组织中α-SMA的表达进一步增多,而大柴胡汤组各个时间点胰腺组织中α-SMA的表达均明显减少(见图3)。

图3 大柴胡汤对胰腺纤维化中α-SMA表达的影响 (免疫组化,×200)Figure 3 Effect of Dacaihu decoction on α-SMA expression in pancreatic fibrosis in CP (immunohistochemical method,×200)

2.2.3 大柴胡汤对慢性胰腺炎模型胰腺纤维化进展中EMT相关调控蛋白表达影响 Western blotting检测结果显示:与空白组相比,CP组胰腺组织N-cadherin在造模第2,4周没有明显变化,但在第6周明显高于空白组(P<0.01);而E-cadherin在空白组呈现一定的表达,造模第2周没有明显变化,但在第4,6周明显降低(P<0.01)。与CP组相比,大柴胡汤组N-cadherin表达在第6周显著下降(P<0.01),而E-cadherin表达在第6周显著升高(P<0.01,见图4)。提示慢性胰腺炎进展中伴随EMT发生;而大柴胡汤治疗后可明显降低N-cadherin表达,升高N-cadherin表达,提示大柴胡汤可通过抑制EMT进程,改善胰腺纤维化,对慢性胰腺炎有治疗效果。

与对照组比较,**P<0.01;与CP组比较,##P<0.01图4 大柴胡汤对胰腺纤维化进展中E-cadherin、N-cadherin蛋白的影响Figure 4 Effects of the Dacaihu decoction on expression of E-cadherin and N-cadherin proteins in the progression of pancreatic fibrosis

3 讨论

CP病因复杂,与胰腺癌的发生关系密切[15],确诊后20-25年的死亡率为50%[16],CP的主要病理改变为胰腺纤维化,研究胰腺纤维化的发生发展机制具有重要意义。

关于CP的发病机制,近年来的多项研究表明,胰腺纤维化的本质是以胶原为主的ECM合成增多,降解减少,导致过多的ECM(如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原)沉积[17,18]。新近的研究发现,器官纤维化中异常聚集的成纤维细胞至少有1/3是经EMT而来的[3,4]。EMT是Greenberg和Hay在1982年首次提出的[19],指上皮细胞发生转化、失去极性,转化为间质细胞的过程。之后的大量研究发现,EMT存在3种类型:即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,它们属于3种不同的生理病理过程。Ⅰ型主要发生在胚胎时期,参与胚胎的正常发育。Ⅲ型主要见于癌组织,与肿瘤细胞的浸润与转移有关。Ⅱ型主要见于组织纤维化进程中,参与损伤修复、组织再生和器官纤维化。EMT进展过程伴随多个细胞分子标志物的变化。即上皮组织标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)、β-连环素(β-catenin)等表达减少;而间叶组织标记物如波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏素(N-cadherin)、纤连蛋白(Fibronectin)表达上调,其中E-cadherin表达下调是EMT发生中最重要的分子事件[20]。

研究发现,活化的胰腺星状细胞在胰腺的促纤维增生反应中发挥核心作用。PSC通常位于腺泡周围,处于“静止”状态,PSC受到刺激后会从正常的“静止”状态转变为“激活”状态(也称为“肌成纤维细胞”状态)。活化的PSC增殖、迁移并产生大量的ECM、细胞因子、趋化因子和生长因子[9,21,22]。本研究发现,CP组随着造模时间的延长,E-cadherin的阳染表达呈下降趋势,在第4,6周明显降低(P<0.01),而N-cadherin的阳染表达呈上升趋势,在第6周明显高于空白组(P<0.01),提示在CP病程进展中发生EMT样转化过程。随造模时间的延长,PSC活化的重要标记物α-SMA表达明显增高,提示PSC活化与胰腺纤维化进展中EMT过程相关。

中医将慢性胰腺炎归结为“腹痛、胃心痛、胁痛、泄泻、瘕”等病症范畴,多由外邪入侵、情志不舒、暴饮暴食、恣食肥甘或创伤等导致肝胆不利,内生湿热,堆滞中焦,中焦气机不舒,随后气滞血瘀生湿蕴热,邪热壅塞。因此,对慢性胰腺炎的治疗,一般在疏肝理气,活血化瘀的基础上使用清热化湿,通里泄热的药物。大柴胡汤临床治疗胰腺炎疗效确切[23,24],课题组前期实验证明,大柴胡汤可抑制TGF-β/Smad信号通路的活化,调节MMP-1/TIMP-1的平衡,有效遏制CP病程进展中ECM合成[11-13],进而减轻胰腺纤维化。本研究发现,与CP组相比,大柴胡汤组第6周,α-SMA表达明显减少,N-cadherin表达显著下降(P<0.01),而E-cadherin表达显著升高(P<0.01)。提示大柴胡汤可以降低PSC的活化,减缓EMT进程,改善胰腺纤维化,对慢性胰腺炎有治疗效果。

综上所述,EMT参与CP小鼠胰腺纤维化进展,大柴胡汤不仅可以抑制α-SMA表达,降低PSC活化,而且可以减缓EMT进展,进而减少胰腺炎症环境中ECM生成,改善CP小鼠纤维化。

致谢:本实验在陕西省国际合作基地-免疫炎症相关疾病中医药防治国际联合研究中心各位成员的鼎力相助下圆满完成。在此表达最诚挚的谢意!