基于网络药理学和成分敲除/敲入的中药多维药效物质基础研究方法

★ 蒋运斌 杨荣平 祝婧（.西南大学药学院/中医药学院 重庆 40075；.江西中医药大学 南昌 330004）

中药质量的整体评价是中药现代化、国际化的重要前提，也是中药产业健康快速发展的重要保障，其关键在于如何实现中药药效物质基础的整体发现。近年来，涌现了一批能体现中药整体观的现代科学技术，如谱效关系［1］、成分敲除 /敲入［2］、网络药理学［3］、质量标志物（Q-Marker）［4］，已广泛应用于中药药效物质基础的研究。上述技术的应用，使得中药药效物质基础的发现开始体现中药整体观的特点，推动了中药质量的整体评价。然而，目前基本上都是基于单一功效的药效物质基础整体发现，不符合中药多重功效的特点。要实现名副其实的中药药效物质基础的整体发现，不仅需要采用能体现中药整体观的研究技术，而且还需要考虑中药多重功效的特点。

多重功效是中药的特点，在中药中普遍存在［5］，如三七可散瘀止血、消肿定痛，风湿马钱片可祛风除湿、活血祛瘀、通络之痛。药效成分是中药功效的物质基础，中药不同功效所对应的药效物质基础具有差异性，即中药药效物质基础具有“多维性”。中药多维药效物质基础是不同功效相关的药效成分的集合。剖析中药多维药效物质基础是实现整体监测中药药效物质基础的前提，科学辨识中药多维药效物质基础，是实现中药质量整体评价的前提。本研究提出了以能体现中药整体观的网络药理学和成分敲除/敲入技术分别对中药不同功效所对应的药效物质基础进行预测和验证，发现中药的多维药效物质基础，全面系统评价中药药效物质，可为最终实现中药质量的整体评价奠定基础。

1 中药药效物质基础监测的现状

含量测定是中药质量标准中的重要项目［6］，首选有效成分作为含量测定项下的监测成分，故中药药效物质基础的发现是实现中药质量评价的重要前提。中药药效物质基础的发现经历了基于活性追踪分离的单一药效成分发现模式到基于整体观的多药效成分发现模式，故中药药效物质基础的监测也经历了从单一成分到多成分的发展过程。

1.1 单一成分监测模式 截至目前，监测单一成分在中药质量控制中仍十分普遍。《中国药典》2015版收载的在含量测定项下通过监测单一成分控制质量的中药普遍存在，如丁香Caryophylli Flos通过监测丁香酚的含量、川牛膝Cyathulae Radix通过监测杯苋甾酮的含量、二陈丸通过监测橙皮苷的含量、大川芎口服液通过监测天麻素的含量来控制其质量。目前仍存在较多采用监测单一成分来控制中药质量的研究报道，如马雪等［7］采用监测异牡荆苷以控制酢浆草的质量，刘慧等［8］通过监测藤黄双黄酮以控制人面果叶的质量。这种通过监测单一成分控制中药质量的方法不符合中药“多成分多靶点”作用模式，不能体现中药整体观的特点。

1.2 多成分及整体成分监测模式 随着人们认识到中药药效物质基础是由多种成分构成的而非单一成分，中药质量控制也开始注重多成分及整体成分的监测。《中国药典》2015版收载的在含量测定项下通过监测多成分控制质量的中药已占有相当大的比例，如人参通过监测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，双黄连片通过监测黄芩苷、绿原酸、连翘苷的含量以控制其质量；同时也采用指纹图谱对一部分中药进行整体成分监测以控制其质量，如三七通舒胶囊、天舒胶囊。通过监测多成分或整体成分控制中药质量已成为广大专家学者的共识，近年来的研究报告也展现了这一趋势，如王怀友等［9］采用指纹图谱技术对毛冬青的整体成分进行监测，黄博等［10］采用多指标成分定量分析和指纹图谱技术对肿节风颗粒进行多成分及整体成分监测，马欣等［11］采用多维指纹图谱技术对银杏叶提取物进行多维整体成分监测，以控制其质量。

2 基于网络药理学的中药多维药效物质基础预测

2.1 网络药理学已被广泛用于中药药效物质基础的预测 网络药理学概念从提出到现在仅有10余年时间［12-13］，由于其理念和中药整体观不谋而合［14］，所以其已经广泛应用于预测中药药效物质基础。Lee等［15］采用网络药理学对Yijin-Tang抗高脂血症和动脉粥样硬化的药效物质基础进行了预测，结果表明柚皮素、川陈皮素、橙皮苷、高良姜素、甘草甜素、高龙胆酸、豆甾醇、6-姜酚、槲皮素和光甘草定可能是其主要药效物质基础。熊婷等［16］采用网络药理学对牛膝防治阿尔茨海默病的物质基础进行了研究，结果表明牛膝中黄酮类、蒽醌类可能是其治疗阿尔茨海默病的物质基础。

2.2 网络药理学预测中药多维药效物质基础的研究思路 基于网络药理学预测中药药效物质基础的常规工作流程如下所示（图1）［15,17,18］。

（1）成分的收集：成分的收集可以分为两种情况，一是数据挖掘，即依靠各种数据库和文献检索确认中药所含化学成分；二是基于实验，即通过实验获得中药所含成分。常用于收集成分的数据库：TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），ETCM（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/），SymMap（https://www.symmap.org/）。

（2）成分的筛选：成分的筛选可以分为两种情况，一是直接应用，即不经过吸收、分布、代谢、排泄、毒性（ADMET）筛选，直接用于下一步成分靶标的确认；二是ADMET筛选，即将所有收集的成分经过ADMET筛选，筛选过关的成分才能用于下一步成分靶标的确认。FAFDrugs4（http://fafdrugs4.mti.univ-paris-diderot.fr/） 是 可用于ADMET筛选的在线平台。此外也可用成分的口服生物利用度和类药性对其进行ADMET筛选［15］，TCMSP数据库可以查询化合物的口服生物利用度和类药性值。

（3）成分靶标的确认：成分靶标的确认可以分为两种情况，一是数据挖掘，即通过各种数据库查找和文献检索确认成分的靶标；二是预测，通过化学相似性或药效团在各种数据库中预测成分的靶标。数据挖掘和预测可以根据具体情况灵活选用。TCMSP、ETCM、SymMap数据库可以查询成分靶标，常用于预测成分靶标的数据库：STITCH（http://stitch.embl.de/），SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/），PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）。

（4）疾病靶标的确认：首先确认最能体现中药功效的相关疾病，然后通过文献搜索、数据库查找确认疾病靶标。常用于查找疾病靶标的数据库：OMIM（https://omim.org/），DisGeNET（http://www.disgenet.org/），Therapeutic Target Database（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），Gene Expression Omnibus（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。

（5）成分、疾病共同靶标的确认：取（3）和（4）的交集，获得成分、疾病的共同靶标。常用维恩图分析实现，维恩图分析可在在线平台Omicshare上实现（https://www.omicshare.com/tools/）。

（6）成分-共同靶标网络关系的构建：基于（3）的结果，构建成分-共同靶标的网络关系。

（7）药效物质基础的预测：分析成分-共同靶标网络的拓扑结构，预测药效物质基础。常用Cytoscape（https://cytoscape.org/）进行分析。

（8）通过（1）-（7）的操作可以预测中药单一功效的药效物质基础，重复（1）-（7）的操作即可预测中药不同功效的药效物质基础，即中药的多维药效物质基础。

此外，在实际操作过程中还经常遇到（3）和（4）无交集或交集靶标很少的情况，在这种情况下无法建立成分-疾病靶标的网络关系。当遇到这种情况时，可以通过分子对接建立成分与疾病靶标的网络关系。

图1 基于网络药理学预测中药药效物质基础的工作流程

3 基于成分敲除/敲入的中药多维药效物质基础验证

3.1 成分敲除可从整体观出发对中药药效物质基础进行研究 如何从整体观出发对中药药效物质基础进行验证，一直以来都是中药药效物质基础发现过程中不可避免的难题。肖小河等［19］提出的“基于目标成分敲除的中药药效物质辨识”为解决这一难题带来了曙光，该研究思路将中药作为一个整体进行研究，始终以中药整体为基础对目标成分的药效进行分析，能较好地体现中药整体观的特点。目前成分敲除技术已广泛应用于中药药效物质基础的辨识［20］，如李贵云等［21］采用成分敲除技术确认菲类成分为灯心草抗焦虑作用的主要有效成分,Wei-Jun Kong等［22］采用成分敲除技术确认了去氧胆酸、猪去氧胆酸是牛黄抗菌的关键成分。

3.2 基于成分敲除验证中药多维药效物质基础的研究思路 网络药理学只能从整体观出发对中药多维药效物质基础进行预测，需要对预测结果进一步验证才能确定中药多维药效物质基础。基于成分敲除验证中药药效物质基础的常规工作流程如图2 所示［19］。

（1）样品制备：按提取方法获得全成分样品，然后基于制备薄层、制备液相、柱色谱等方法，制备合格的目标成分样品、目标成分阴性样品。

（2）药效比对：采用与中药功效相关性好、指标灵敏易观察、可操作性强的药理试验模型（如动物或细胞模型）和方法，对比3种样品（全成分样品、目标成分样品、目标成分阴性样品）的药效差异。

（3）结果分析：基于3种样品的药效试验结果，可以分析确定目标成分是否为中药的主要药效成分。

（4）通过（1）-（3）的操作可以验证中药单一功效的药效物质基础，重复（1）-（3）的操作即可验证中药不同功效的药效物质基础，即中药的多维药效物质基础。

虽然基于成分敲除技术的中药药效物质基础研究较好地体现了中药整体观，但在实际操作过程中仍有相当大的难度，主要体现在目标成分阴性样品的制备。中药基质复杂，将目标成分从全成分样品中分离，制得合格目标成分阴性样品难度较大。在实际操作过程中，往往全成分样品在成功剥离目标成分后，发现目标成分阴性样品除了目标成分缺失外还常伴有其他成分的缺失，使得目标成分阴性样品达不到要求。

图2 基于成分敲除验证中药药效物质基础的工作流程

3.3 基于成分敲入验证中药多维药效物质基础的研究思路 成分敲入概念也是由肖小河等［19］提出的，其主要用于研究中药量效关系，确定中药质量标准中目标成分的上/下限；在研究过程中同样也涉及到目标成分阴性样品的制备。借助成分敲入的思路，并结合目标成分阴性样品制备难度大的实际情况，本研究对成分敲入研究思路做了少许改动，用于验证中药药效物质基础，改动的巧妙之处在于以“目标成分阳性样品”代替“目标成分阴性样品”，不仅解决了目标成分阴性样品制备难度大的问题，而且保留了方法的整体观特性。研究思路如图3所示。

（1）量效关系的确认：研究不同剂量全成分样品与药效学关系，寻找到一定剂量范围内全成分样品与药效明显正相关。

（2）目标成分样品的制备：如果目标成分是单一成分，采用实验方法制备或直接购买；如果目标成分是成分群，采用实验方法进行制备。

（3）目标成分阳性样品的制备：向全成分样品加入一定量的目标成分，得到目标成分阳性样品。

（4）全成分样品剂量的选择：根据目标成分阳性样品中目标成分的含量，选择目标成分含量对等的全成分样品剂量。全成分样品剂量需要控制在（1）所确定的正相关剂量范围内。

（5）药效比对、结果分析同成分敲除模式。

（6）重复（1）-（5）的操作即可验证中药不同功效的药效物质基础，即中药的多维药效物质基础。

图3 基于成分敲入验证中药药效物质基础的工作流程

4 结语

中药药效物质基础监测的现状与发展显示，对中药药效物质基础的监测正在从单一成分到多成分甚至整体成分发展，表明随着时间的推移，对中药药效物质基础的监测更能体现中药整体观。从单一成分到多成分甚至整体成分的监测，看似中药药效物质基础在发展过程中实现了整体监测，但现行监测的中药多种药效成分大多是基于化学药物研究思路得来的，严重偏离了中药整体观的特点。随着可体现中药整体观的技术广泛运用于中药药效物质基础的发现［1-4］，目前已积累了一定数量的基于整体观的中药药效物质基础研究结果，但基本没有用于中药质量的控制，即从基础研究到实际应用处于脱节状态，有待加强。然而，目前在采用能体现中药整体观的技术研究中药药效物质基础时，基本上只考虑了中药的单一功效，这不符合中药普遍具有多重功效的特点。综上，中药药效物质基础监测虽已由单一成分监测模式逐渐向多成分或整体成分监测模式转换，但真正实现中药质量的整体评价仍有较大差距。

中药药效物质基础的研究不仅要考虑采用能体现中药整体观的研究技术，而且还需要考虑中药多重功效的特点，只有两者有机结合起来才能使研究的中药药效物质基础更好地体现中药整体观。笔者认为，在中药多维药效物质研究中，将能体现中药整体观的网络药理学和成分敲除/敲入技术有机结合，对中药药效物质基础进行快速预测和科学验证，全面解析中药不同功效的药效物质基础，即中药的多维药效物质基础，可为实现名副其实的中药质量的整体评价奠定基础。此外，本文还提出了新思路解决了成分敲除/敲入技术中目标成分阴性样品制备难度大的问题，促进了成分敲除/敲入技术在中药药效物质基础研究中的应用。综上，本文可为中药多维药效物质基础研究提供参考，促进中药质量的整体评价，助力中药现代化、国际化。