消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌作用机制的网络药理学分析

★ 吴竞 陆运鑫 唐友明 侯恩存 郑景辉 唐伟智 谢俊宇（.广西中医药大学研究生院 南宁 53000；.广西中医药大学附属瑞康医院 南宁 5300）

目前，原发性支气管肺癌（简称肺癌）在全球范围仍然是发病率和死亡率最高的癌症之一，其总的5年生存率仅为17 %［1］。截止至2017年，我国的肺癌人数达80万例，死亡人数达70万例，占全球肺癌总人数的40 %［2］，严重威胁人类健康。其中，非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer）占所有肺癌类型的85 %以上，肺癌的控制已成为全世界广泛关注的问题［3］。由于确诊时绝大多数患者已处中晚期，化疗是非小细胞肺癌最主要的治疗手段，但随着疾病进展，常常出现耐药情况。消积化瘀丸中药方由黄芪、党参、三七、山慈菇、菟丝子、蛇六谷、鳖甲、全蝎、蜈蚣、生牡蛎、守宫、土鳖虫、鹿角胶和炮山甲等14味药组成，具有扶正清毒、化瘀消积之效。相关研究表明［4-6］，消积化瘀丸在恶性肿瘤的辅助治疗中起到减毒增效、提高免疫功能、改善生存质量等作用。

为揭示消积化瘀丸中药方中的具体成分治疗非小细胞肺癌的作用机制，本研究采用网络药理学方法进行探析。网络药理学是结合了网络数据和药理学的一门新兴学科［7］，可在分子层面通过对多个复杂网络和 多水平相互连接，来阐明药物活性成分和靶点、靶点和疾病以及蛋白相互作用等多方面的关联以及功能，从而得出多成分、多靶点、多通路的潜在作用机制［8-10］，为临床工作提供一定的指导依据。

1 资料与方法

1.1 数据库检索 本研究涉及到的数据库包括：中药药理学分析平台系统（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）；Drugbank（www.drugbank.ca/）；Batman（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；CTD（http://ctdbase.org/）；Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；KOBAS 3. 0 （http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）；uniprot（https://www.uniprot.org/）；STRING（https://string-db.org/）；Omicshare（http://www.omicshare.com/）；cytoscape3.6.1（http://www.cytoscape.org/）。

1.2 消积化瘀丸药物活性成分收集与筛选 消积化瘀丸中药方中包含植物类和生物类共14味药，分别为黄芪、党参、三七、山慈菇、菟丝子、蛇六谷、鳖甲、全蝎、蜈蚣、生牡蛎、守宫、土鳖虫、鹿角胶和炮山甲。通过中药药理学分析平台系统（TCMSP），根据口服生物利用度（oral bioavailablility，OB）数值越高，类药性（Drug likeness，DL）越好的原则［11-12］，设定 OB ≥ 30 %和DL≥0.18为限定条件进行药物活性成分筛选，再利用 Batman（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库、Drugbank（www.drugbank.ca/）进一步完善药物活性成分收集。最后将各数据库收集到的药物活性成分进行整合。

1.3 消积化瘀丸药物活性成分的靶点预测 将TCMSP数据库筛选得到的药物活性成分上传至PharmMapper服务器平台（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/），设定返回靶点数目并选择药效团模型，呈交后由该服务器平台反馈得到预测靶点。将预测靶点导入uniprot进行格式转换及校正，从而得出人源相关性的靶点。进一步收集Batman数据库、Drugbank数据库中药物成分对应的靶点，最后将各数据得到的靶点进行合并去重。

1.4 非小细胞肺癌靶点蛋白获取 通过CTD（http://ctdbase.org/）数据库、OMIM（http://www.omim.org/）数据库输入相关检索式检索得到非小细胞肺癌的相关靶蛋白，收集合并去重。

1.5 消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌的蛋白互作图 将1.3和1.4中所得到的药物预测靶点和疾病靶蛋白一起导入 Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）系统平台，制作Venn交集图并提取两者交集靶点，进而将交集靶点通过STRING（http://string-db.org/）在线平台构建蛋白互作网络图（PPI），该软件可对所有蛋白相互作用信息进行评分，分值越高表明蛋白相互作用的可信度越高［13］。最后使用cytoscape3.6.1对PPI网络图进行可视化处理和分析。

1.6 构建成分-靶点、靶点-通路关系图 作者将上述步骤中得到的药物活性成分、交集靶点以及信号通路的信息共同导入cytoscape3.6.1（http://www.cytoscape.org/）软件，以节点（node）表示成分、靶点和通路，边（edge）表示两者之间的相互作用，构建并绘制出成分-靶点和靶点-通路网络关系图。

1.7 消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌的靶点GO分析和通路注释 为揭示和阐明消积化瘀丸药物活性成分治疗非小细胞肺癌的预测靶点基因功能和信号通路作用，可将1.5中的交集靶点蛋白通过生物学信息注释库（https://david.ncifcrf.gov/，DAVID）进行基因本体（GO）功能富集分析，选择生物过程（BP）、细胞结构（CC）和分子功能（MF）3个模块绘制柱状图，然后采用KOBAS 3.0（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）制作KEGG信号通路图并进行通路注释，并利用Omicshare（http://www.omicshare.com/）制作高级气泡图。

2 结果

2.1 消积化瘀丸药物活性成分收集与靶点预测的结果 通过中药药理学分析平台系统（TCMSP），以OB≥30 %和DL≥0.18为限定条件，收集到植物来源活性成分共63个，其中黄芪20个，党参21个，菟丝子11个，三七8个，山慈菇3个。通过Batman数据库收集到动物来源活性成分共28个，其中全蝎7个，蜈蚣7个，生牡蛎6个，鹿角胶2个，炮山甲2个，守宫2个，土鳖虫1个，鳖甲1个。另外，蛇六谷的活性成分因相关数据库资料不齐全，查找相关文献得到蛇六谷成分1个，共计92个（表1）。下一步将TCMSP数据库筛选出来的药物活性成分提交由PhramMapper服务器平台进行预测靶点反馈，选取反馈评分（Fit）最高的前30位预测靶点，与Batman、Drugbank数据库靶点合并去重，最终筛选出消积化瘀丸具有潜在抗肿瘤作用的预测靶点共计1 254个。

表1 消积化瘀丸药物活性成分

（续表）

2.2 非小细胞肺癌靶蛋白收集结果 利用CTD数据库、OMIM数据库，通过Pubmed MESH获取相关检索式，如 Non-Small Cell Lung Cancer；NSCLC ；Carcinoma，Non-Small-Cell Lung ；Lung Neoplasms检索得到非小细胞肺癌相关靶蛋白，最终筛选得到该疾病靶蛋白共计21 513个。

2.3 消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌蛋白互作网络图的构建和分析 将上述筛选的1 254个药物预测靶点与21 513个疾病靶蛋白导入Draw Venn Diagram平台，制作Venn交集图，得到874个药物-疾病交集靶点蛋白，即为消积化瘀丸对非小细胞肺癌具有潜在治疗作用的核心靶点（图1）。

图1 消积化瘀丸预测靶点与非小细胞肺癌靶蛋白的Venn交集图

为进一步说明交集靶点蛋白之间的互作机制，通过STRING在线平台，设定为人源相关性（Homo sapiens），制作蛋白-蛋白相互作用网络图（PPI），分析显示消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌的蛋白互作网络中，有866个节点（nodes），即有866个相互作用蛋白；有10 611条边，即10 611条相互作用关系。进而利用cytoscape 3.6.1软件对该PPI网络图可视化处理，并使用NetworkAnalyzer插件进行分析（图2）。在该网络中，节点的度（Degree）表示与节点相连的边数，度值越大，边数越多，说明该节点在整个网络中的作用越重要。结果显示关键靶蛋白有AKT1、IL6、MYC、JUN、MAPK1等，其中度值最高（Degree=196）的靶蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）。

图2 消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌的蛋白互作网络图

2.4 药物活性成分-靶点、靶点-通路关系图的构建结果 为进一步探究消积化瘀丸中不同药物活性成分对非小细胞肺癌治疗的作用机制，作者将药物活性成分、核心靶点以及疾病靶蛋白放入cytoscape软件进行可视化处理和分析（图3、图4）。根据网络拓扑学性质，选取度值（Degree）较高药物活性成分节点（Node）进行分析，连线（Edge）较多的节点在该网络中可能起到主要治疗作用［14］。分析结果表明，Degree值排在前5位的药物活性成分为adenine（腺嘌呤）、Stearic Acid（硬脂酸）、Tyrosin（酪氨酸）、leucine（亮氨酸）和Cholesterol（胆固醇）。

图5 消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌作用靶点GO分析的条状图

图4 核心靶点-信号通路相互关系图

2.5 消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌靶点的GO分析结果 为进一步明确874个药物-疾病交集靶点的潜在功能，作者使用DAVID数据库进行GO分析，选择生物过程（BP）条目1 020个，细胞组成（CC）条目121个，分子功能（MF）条目246个，根据P<0.05原则提取各条目的排名前20位，分析结果显示（图5 A B C），在生物过程中，氧化还原过程、药物反应、DNA模板转录正调节以及细胞增殖负调控等排位靠前；在细胞组成中，主要包括细胞质、胞液、质膜和细胞外泌体等；在分子功能中，蛋白结合、三磷酸腺苷结合、同等蛋白结合以及蛋白质同源二聚化活性等排在前面。通过KOBAS 3.0平台进行KEGG生物通路分析（图6），再利用Omicshare绘制高级气泡图（图7），设定P<0.05选取前20条通路，气泡从绿色到红色表示P由大到小，气泡面积大小反应基因数量的多少。结果显示消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌的作用机制主要涉及 Carbohydrate digestion and absorption 信号通路、Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption信号通路、Fatty acid degradation信号通路、Salivary secretion 信号通路和 Pancreatic secretion 信号通路等。

图3 消积化瘀丸药物活性成分-核心靶点相互关系图

图6 Carbohydrate digestion and absorption信号通路

图7 消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌作用靶点KEGG通路富集的气泡图

3 讨论

肺癌在我国传统医学中早有记载，当属“咳嗽”“肺积”“咯血”等范畴，其病理基础为正气不足，气血阴阳失调，以及脏腑功能紊乱，与痰、瘀、毒、虚相关，人体防卫功能下降，邪气趁虚而犯引起［15］。其证型多种多样，而尤以本虚标实、虚实夹杂多见。贾英杰［16］认为肺癌发病毒瘀互结是主要原因，加之三焦气机升降失调，日久成积，其中“毒”“瘀”始终存在于整个疾病过程。周计春等［17］也提出了癌邪之毒是肺癌产生和转移之根本原因的观点，并与痰、瘀、热等密切相关。

根据此次研究结果，cytoscape分析提示消积化瘀丸方中的主要药物活性成分包括adenine（腺嘌呤）、Stearic Acid（硬脂酸）、Tyrosin（酪氨酸）、leucine（亮氨酸）和Cholesterol（胆固醇）等，其中度值最高为adenine（腺嘌呤）。刘飞飞等［18］研究表明，腺嘌呤与顺铂联用时，可明显增加细胞凋亡速率。另外，李慧敏等［19］细胞实验显示，硬脂酸可能是通过抑制自身磷酸化的方式诱导肺癌细胞自噬，抑制肿瘤细胞增殖。这也证实了消积化瘀丸的药物活性成分具有增效减毒之功。PPICN分析显示，关键作用靶点有AKT1、IL6、MYC、JUN和MAPK1等。AKT-1（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）作为一种癌基因，其表达水平越高，癌细胞分化程度越低，恶性程度越高。IL6（白细胞介素6）是介导炎症产生的重要因素，与肿瘤之间需建立一种反馈信号来调节细胞生长［20］。朱星宇［21］研究显示，在NSCLC患者血清中IL6水平显著高于正常人。KEGG生物信号通路分析可知，Carbohydrate digestion and absorption（糖类消化与吸收信号通路 ）、Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption（内分泌等因素调节钙离子重吸收信号通路）以及 Fatty acid degradation（脂肪酸降解信号通路）等为消积化瘀丸作用于非小细胞肺癌的主要生物途径。已有研究证明，糖代谢异常是促进肿瘤微环境形成最为关键的一环［22］，与正常细胞有氧氧化提供能量不同，肿瘤微环境常处于缺氧状态，缺氧会使肿瘤细胞进行无氧糖酵解，即“Warburg效应”，该效应广泛存在于包括肺癌等多种恶性肿瘤中，与其生物学行为密切相关，如增殖转移、免疫逃逸、抗凋亡等［23-24］，而大量的糖酵解又给肿瘤细胞的繁殖提供了充足的能量，使其不断生长。本次研究发现主要活性成分腺嘌呤在糖类消化与吸收信号通路中作用于为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶靶点，也证实了上述研究者的观点。

综上所述，消积化瘀丸治疗非小细胞肺癌消积化瘀丸可能通过调节细胞糖代谢、抗炎等方面抑制肿瘤细胞增殖及增加细胞凋亡速率，多靶点、多通路发挥抗肿瘤作用。中药多种药物活性成分在靶点上的协同效应，使其表现出多途径、多功能的治疗特点，此外，药效叠加以及毒性分散也是中医药治疗肿瘤的特色之一［25］。这些特点使中药更具优势，同时也对中药的化学成分、作用机制提出了更多疑难问题［26］。网络药理学与中药结合则是中医药未来发展的一大趋势，本研究中一些药物活性成分的收集筛选尚有不足，以及网络靶点预测等不可控因素，研究结果尚需进一步探讨。