西洋参组织培养研究近况及其技术相关问题的探讨

路俊仙，郭瑞齐，林慧彬

（山东省中医药研究院，山东 济南 250014）

西洋参为五加科植物西洋参（Panax quinquefolium L.）的干燥根，原产于加拿大和美国，我国始载于清朝汪昂《补图本草备要》。西洋参能养阴润肺，清心安神，有人参的补性而无人参的燥性［1］，是药食两用的名贵补品。市场需求量一直较大，但价格始终居高不下。其原因在于：西洋参种植周期长、产量低［2］；生产中依靠种子繁育种苗却受限于种子产量低及其严重的后熟现象［3］，造成栽培用实生苗供应不足，限制其种植面积的扩增，进而制约西洋参总产的提高。

组织培养技术通过植物离体细胞、组织、器官等在培养基上诱导形成愈伤组织或者进一步分化长成新植株，不受环境、气候、病虫害影响，可实现全年稳定生产，还可通过优良品种筛选、细胞株筛选、冠瘿组织培养加快目标产物的生物转化、提高得率［4，5］。目前西洋参组织培养研究多集中于利用冠瘿组织培养生产次生代谢物及外植体诱导愈伤组织，大规模生物发生器扩大研究较少，西洋参成功分化再生植株和育种的研究也很少。一方面急需建立西洋参细胞、冠瘿组织和毛状根的大规模工业化生产体系，提取西洋参药效成分；另一方面需建立成熟稳定的西洋参快繁体系，大规模快速繁殖西洋参种苗并培育新品种，摆脱自然环境条件的限制，满足栽培需求，解决西洋参供求矛盾，提高西洋参产业的经济效益和社会效益。本文就西洋参组织培养的应用领域、技术方法、存在问题及解决措施进行归纳总结，为西洋参组培技术的进一步优化提供研究依据和思路。

1 组织培养在西洋参研究中的适用性

1.1 无毒种苗的快速生产

西洋参生长周期较长，种植4～5年后才能结种，致使种子稀缺且价格高昂，约 1 000美元/kg［6］。种子需经形态后熟和生理后熟方能发育完全，休眠期达200天左右，极大限制了栽培用实生苗的供应量，继而限制西洋参的种植规模和市场供应。采用组织培养进行离体快繁，能够避开西洋参植株结种和种子休眠期的限制，能在短期内提供大量栽培用实生苗，满足大规模生产的需求，同时缩短西洋参的种植周期，加快市场供应。目前组织快繁西洋参虽已开展较多研究，但多限于愈伤组织的诱导和培养，有关西洋参分化培养的实验条件还需进一步优化，至今仍未建立稳定可行的完整技术体系，急需对此加强研究。

1.2 优良品种的培育

自20世纪80年代至今，我国引种西洋参已有40余年。迫于栽培初期种苗缺乏、有苗就栽的窘境及参类植物种间杂交具有亲和性，西洋参种质混杂现象日益严重，至今国内外尚无西洋参栽培优良品种，现有西洋参普遍存在种质退化、抗性和产量下降问题，严重影响西洋参产业的发展，急需选育抗病性强、产量高、生长健壮的优良品系［7］。育种工作的基础是种质资源，西洋参种质收集保存的数量和质量直接决定了育种的成功与否。为此应构建西洋参核心种质，整合多学科、多技术开展多元化优良品种选育。西洋参组培技术能够有效保存植物种质，借助基因工程等生物学技术改良品质并繁育优良品种［8，9］，从而提高西洋参的品质和产量，推动西洋参产业的高质量、快速发展，满足人们的健康需求。

1.3 次生代谢产物的生物转化

次生代谢产物多数是药用植物的有效成分，具有重要的药理作用和生理活性［10］，如西洋参中含有人参皂苷Rb1、Re、Rg1等多种皂苷类成分及多糖、氨基酸等，是其改善心血管［11，12］、抗Ⅱ型糖尿病［13］、抗癌［14］、提高免疫力［15］、抗氧化［16］等多种药理活性的物质基础。实际上西洋参中这些化学成分的含量较低，构建有效成分的快速合成体系提高产量并开展大规模的提取研究意义重大。采用组培结合转基因技术获得不同基因型的冠瘿组织或者毛状根，并通过不断优化培养条件，可加速细胞繁殖，定向高效诱导西洋参次生代谢产物。此外西洋参冠瘿组织或毛状根培养过程中细菌污染率较低，更利于大规模工厂化培养和生产特定成分。研究表明，采用细胞悬浮培养，较固体培养基培养其生长速率可提高80%，且无需加入外源激素，所得次生代谢物含量高、遗传性状稳定。这也是未来西洋参有效成分快速获得的有效途径。

2 西洋参组织培养的技术方法

2.1 外植体的选择和处理

外植体是决定组培成功与否的首要因素。外植体的选择因素包括取材部位和取材时间。尽量选取温室或人工气候条件下培养的健壮无病虫害优良植株，其生长旺盛、状态良好的器官、组织和细胞更是获得高活力外植体的前提，这对原生质体的复壁、分裂、愈伤组织的形成及植株再生有重要影响。西洋参外植体取材部位较多，花药、花蕾、叶片、叶柄、子叶、胚轴、根、茎段、根髓、胚等材料均可，其中种胚、子叶、芽苞、叶柄、根的愈伤组织诱导率在69% ～98%，是较好的外植体［17，18］。此外诱导率也受外植体器官本身所处的生理状态、发育时期及其细胞所处的分裂期的影响［19］。不同生长时期外植体愈伤组织诱导率差异显著，取材时间春季为宜，植物体生长旺盛，细胞活力强，获得的外植体愈伤组织污染率最低、诱导率最高。刘本叶等［18］研究表明，5月底前后叶片外植体诱导率在95%以上，到6月底取材，诱导率降至30%左右。

2.2 培养基的选择

公认MS培养基最适于西洋参组织培养，采用1/2 MS、White培养基的研究偶见报道。根据培养阶段、培养目的又将培养基分为诱导培养基、继代培养基、分化培养基和生根培养基。这些培养基主要以MS基本培养基为基础，通过添加不同种类、不同比例的生长激素、矿物质、蔗糖等植物生长调节剂配制而成。目前西洋参愈伤组织诱导和培养技术日臻完善和成熟，已为后续培养工作的顺利开展奠定扎实基础。西洋参愈伤组织诱导研究始于1974年［20］，20世纪90年代起至今相关研究［21-28］报道大量出现，结果见表1。

表1 西洋参组织培养条件和培养结果

2.3 植物生长调节剂的优化

生长激素、矿物质和蔗糖等植物生长调节剂对植物生长、分化、再生及代谢产物的形成具有特殊的调节作用，在整个组培过程中起着至关重要的作用。西洋参组培常用的生长激素包括2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）［26-28］、吲哚-3-乙酸（IAA）［26］、萘乙酸（NAA）［22，24］、6-苄氨基嘌呤（6-BA）［22，23］、吲哚丁酸（IBA）［21，23］等。其中2，4-D是诱导离体培养西洋参胚状体发生的必需因子，直接影响愈伤组织形成及胚状体发生。高浓度2，4-D促进愈伤组织发生，诱导率可达100%，但抑制各种材料的胚状体发生，尤其对培养时间长的无菌幼苗的抑制效果明显；相反低浓度的2，4-D均能诱导胚状体发生。生长素IAA、NAA都有助于侧根的发生及生长，诱导能力IAA ＞NAA［26］。矿物质元素同样能够促进愈伤组织诱导和生长。范代娣等［21］测得，MS培养基添加MgSO4含量为92.5 mg/L时，能有效促进嫩茎愈伤组织生长，而MgSO4含量为370 mg/L时，根的愈伤组织生长速度最快。另外添加蔗糖作为碳源或者合适浓度有机物也对西洋参组培有明显的促进作用［17，27］。

西洋参组培过程中除了受到外植体、培养基、植物生长调节剂的成分和配比等因素的影响外，光照、湿度、温度等多种条件也会对西洋参组培产生影响。光照培养和暗培养对西洋参愈伤组织的诱导没有显著影响；光照培养对西洋参胚状体的发生有一定的促进作用。西洋参组培的温度一般在25℃左右为宜。

3 西洋参组织培养中存在的问题

西洋参组织培养除了普遍存在遗传稳定性、玻璃化、褐变及污染等常见问题外，还面临一些其它问题。

3.1 西洋参组织培养多停留在愈伤组织诱导及利用冠瘿组织获取次生代谢产物层面

西洋参组织培养大量研究始于20世纪90年代，已有较长的研究历史，但是进展相对缓慢。目前愈伤组织诱导技术已经成熟，培养冠瘿组织进行西洋参次生代谢化合物的合成研究较多，而真正进行植物再生和快繁的研究寥寥无几，西洋参离体组织培养获得再生植株的研究未见报道。分析认为西洋参组培过程中人参皂苷可以通过细胞分泌进入到周围环境中，大部分皂苷类成分对组培西洋参的生长都具有低浓度促进和高浓度抑制作用［29］。愈伤组织后期的继代培养基及组织分化和生根培养基中，皂苷类成分日益增多，对西洋参生长的抑制作用增强，造成后续工作开展困难。希望研究者可以突破这个问题，推动组培技术在西洋参快繁、育种中的应用，解决西洋参产业发展中的瓶颈问题。

3.2 西洋参组培生根难的问题

鉴于西洋参植物本身的生长惰性，利用外植体进行植株再生过程中发根尤其困难。随着胚状体诱导再生植株技术的出现，这一问题有望解决。研究表明，胚状体遗传相对稳定，再生的植株变异较少。更重要的是体细胞胚具有胚根胚芽两极性，这一特点克服了组培过程中生根培养困难的问题；而且胚状体存在生理隔离，其胚性细胞在发育早期就与其周围的其它细胞形成明显界限，随着发育的进程，最后易与周围组织分离。绕开外植体取自西洋参造成的诱导困难、增殖缓慢的瓶颈，另辟蹊径快速诱导出不定芽，最终成功获得再生植株。

3.3 西洋参的品种混杂问题

目前栽培西洋参种质混杂，缺少优势品种，降低了西洋参的产量和质量。如何采用组织培养技术加快育种进程、改良品种，对西洋参产业发展和资源保护意义重大。而体细胞胚具有单细胞起源的特点，愈伤组织密度高、遗传稳定，是理想的转化受体系统，更易开展离体筛选、外源基因导入和体细胞杂交等新技术育种。另外体细胞胚适合低温保存，解冻后仍可再生且遗传性状稳定，为新技术育种提供了时间和空间上的便利。

4 展望

近年来西洋参组织培养技术发展迅速，培养条件不断优化，体外次生代谢物生产已取得显著进步。但仍存在一些问题需克服，进而实现西洋参产业快速发展。一方面大规模的西洋参生产仍存在困难，将实验室体外培养转化为大规模的工业化生产是今后努力的方向，继续优化体外培养方法和技术，特别是克服各种培养基中皂苷类成分对西洋参生长抑制的瓶颈，促进西洋参大规模工业生产；另一方面组培过程中西洋参愈伤组织诱导及体细胞胚的诱导形成耗时耗力，且生根困难，需综合西洋参研究结果，解析阻碍西洋参组培技术进步的因素，有的放矢、有效缩短培养时间，推动西洋参快繁、育种的进步，有效保存、不断丰富西洋参种质，促进西洋参产业快速发展。