拟南芥O-岩藻糖基转移酶AtPOFUT1的鉴定及生理功能初探

梁 蓉，谢尚强，赵小明，贾晓晨，尹 恒

(1.大连市糖类农用制剂工程研究中心,辽宁省碳水化合物研究重点实验室,中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连 116023;2.中国科学院大学,北京 100049)

糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，不仅影响蛋白质的溶解性、稳定性和催化活性，还与蛋白质折叠、定位和转运等过程密切相关，具有重要的生物学功能[1-2]。根据连接方式和糖链结构的不同，糖基化可以分为多种形式[3]，O-岩藻糖基化就是其中一个重要类型。目前，蛋白O-岩藻糖基化的关键生物学功能已在动物和临床研究中逐步揭示，其与胚胎发育、细胞迁移、肿瘤生长及病灶转移等生理病理过程密切相关[4-9]。

在人体中，蛋白O-岩藻糖基化由O-岩藻糖基转移酶(POFUT1)、GlcNAc转移酶FRINGE、B4GALT1、ST6GAL1等多个酶依次催化完成。HsPOFUT1作为催化此修饰反应的第一个酶，具有重要的生物学功能。如当HsPOFUT1基因被敲除或敲减到极低水平时，NOTCH蛋白的折叠、配体识别及内吞作用等会受到显著影响，进而影响NOTCH信号通路介导的细胞间信息交流及细胞迁移等生物学过程[10-13]。HsPOFUT1主要催化GDP-β-L-岩藻糖(GDP-Fuc)以O-连接方式修饰到含有EGF(表皮生长因子样，Epidermal Growth Factor-Like)重复序列的底物蛋白上[14-15]。除NOTCHs之外，其他含有EGF样重复序列的蛋白同样受到HsPOFUT1的修饰，如人尿纤溶酶原激活剂(uPA)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)和凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅻ等[13]。

然而在植物中，蛋白O-岩藻糖基化的修饰方式及重要功能大部分还处于未知状态，目前相关文献报道极少。2017年，美国杜克大学Taiping Sun团队发现高等植物特有的O-GlcNAc糖基转移酶AtSPY实际是一种O-岩藻糖基转移酶，它可以O-岩藻糖基化RGA蛋白促进其与互作蛋白的结合，从而抑制生长相关基因的转录[16-18]。然而RGA蛋白并不具备EGF序列，说明虽然都是蛋白质岩藻糖基转移酶，但AtSPY与POFUT1的底物选择性存在明显不同。2018年内华达大学的Ian S. Wallace 团队在对拟南芥发育突变体的筛选鉴定时，无意中发现了与HsPOFUT1同源的拟南芥AtPOFUT1在拟南芥生长发育尤其是细胞黏附和花粉管生长方面的重要作用，但是未研究其催化活性[19-20]。

基于上述研究背景，本试验以鉴定研究拟南芥AtPOFUT1为出发点，在序列比对和生物信息学分析的基础上，利用毕赤酵母异源表达AtPOFUT1，确定该蛋白具有岩藻糖基转移酶活性。表达模式分析及后续植株表型明确AtPOFUT1在植物的生长发育尤其是种子发育过程的重要功能。

1 材料与方法

1.1 植物和菌株材料

本试验以模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)为材料，野生型拟南芥植株(wide type，WT)为哥伦比亚生态型 Col-0(Columbia-0)，突变体为同生态型的SALK_151675C，购自TAIR(https://www.arabidopsis.org/)。

本试验所用的克隆菌株E.coliTop10和表达菌株毕赤酵母Pichia pastiros X-33以及pPICZαA质粒，均购于Novagen公司。

1.2 试验试剂与方法

1.2.1 分子及生化试剂 镍柱填料Ni-NTA sepharoseTMexcel column，购自GE Healthcare公司；超滤杯及超滤膜来自默克密理博Merck Millipore公司，超滤膜规格为10 ku。

反转录试剂盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶XhoⅠ、NotⅠ、SacⅠ以及T4DNA 连接酶购于Thermo Fisher公司；Phusion hot star Ⅱ和r-Taq等聚合酶购于宝生物(大连，Takara)有限公司。DNA Marker 购自北京博迈德科技发展有限公司；预染蛋白Marker(Page Ruler Pre-stained Protein Ladder)购于MBI Fermentas公司。

引物由华大基因有限公司合成，具体信息见表1。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in this experiment

PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.2 酶活测定试验 酶活反应体系为纯化酶AtPOFUT1 (2.5 mg/mL) 5 μL，GDP-Fuc (0.1 mg/mL) 5 μL，MgCl2(50 mmol/L) 2.5 μL，Tris-HCl (50 mmol/L,pH=8.0) 15 μL；对照组加入5 μL沸水浴灭活的重组酶AtPOFUT1，其余体系及条件同试验组。在25 ℃恒温反应器孵育2.5 h后，沸水浴10 min终止反应。

利用高效液相色谱(HPLC)检测反应体系中的底物GDP-Fuc的消耗，流动相为2 mmol/L四丁基硫酸氢氨磷酸缓冲液(pH 6.2)。使用Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱，购自Thermo Fisher公司；高效液相色谱系统为依利特 UV230+紫外-可见检测液相色谱仪；GDP-Fuc标准品购自Carbosynth Product公司。

1.2.3 转录组分析 差异表达分析从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因表达综合公共数据库(GEO)筛选拟南芥基因芯片，提取多个转录数组，使用笔者实验室编写的R语言脚本完成[21]；热图分析使用R语言中的pheatmap函数包完成。

1.2.4 植株试验试剂 拟南芥种子用0.1%升汞消毒后，无菌水漂洗，1/2 MS固体培养基培养7～10 d后转移到基质土中。培养条件为22 ℃，80%光照，光周期为12 h/12 h(光照/黑暗)。筛选试剂为草胺膦(PPT)，购于 Sigma-Aldric 公司；基质泥炭土购自丹麦品氏公司。

2 结果与分析

2.1 AtPOFUT1的生物信息学分析

利用HsPOFUT1序列限定在拟南芥基因组中BLAST，获得相似度为12%，综合评分最高的为拟南芥基因AT3G05320。该基因编码的蛋白在拟南芥GT65家族中具有较强的代表性，有一个特征性的DUF246结构域[22]。

AT3G05320编码蛋白由445个氨基酸构成，分子质量为50.65 ku。保守域分析显示其69～384位属于O-FucT-like结构域，表明蛋白可能具有O-岩藻糖基转移酶活性，将该基因命名为Atpofut1。

比较CAZy数据库中获得的注释为拟南芥GT65家族的其他38个O-岩藻糖基转移酶[23-24]，从NCBI获得AtSPY和包括小鼠、果蝇、线虫在内的后生动物的POFUT1，使用MEGA 7.0进行序列比对分析并用Neighbor-joining方法构建系统发育树(图1)显示其进化关系。AtPOFUT1属于一个单独的亚分支，与绝大多数拟南芥GT65家族的糖基转移酶亲缘关系相对较近，但不具有同源性，而与其他物种的POFUT1亲缘关系较远。

在蛋白质序列比对的基础上(图2-A)，分别以CePOFUT1(PDB ID：3ZY5)和HsPOFUT1(PDB ID：5UX6)作为模板，进行AtPOFUT1三维结构的同源模拟，获得了AtPOFUT1两个三维结构模型(图2-B)。由于蛋白序列同源性仅在12%左右，其结构预测的局部和全局评分均较差，可信度低，但是序列匹配的氨基酸极有可能是关键的催化位点。参考三维结构建模及氨基酸序列比对，推测 AtPOFUT1蛋白中关键的催化氨基酸位点是R51、H54、R260和D26，这几个位点可能负责特异性结合GDP-岩藻糖[25-26]。

2.2 AtPOFUT1的基因克隆和异源表达纯化

利用特异性引物Pofut-F及R扩增Atpofut1基因全长，琼脂糖电泳检测PCR产物，有一条长度约为1 300 bp的单一条带，其大小符合Atpofut1的1 337 bp(图3-A)。

分别双酶切PCR产物和pPICZαA质粒并连接，大肠杆菌top10扩增重组质粒并进行双酶切验证。两条条带分别与质粒载体(约4 300 bp)和Atpofut1基因(1 337 bp)大小相符(图3-B)。将重组质粒测序，结果显示重组质粒上的目的基因就是Atpofut1，未发生突变，重组质粒构建成功。

将测序正确的重组质粒pPICZαA-Atpofut1电转到毕赤酵母X-33中，用博来霉素筛选出10个转化子，提取基因组用pPICZαA通用测序引物进行PCR验证，获取两条清晰的条带，2 200 bp条带对应毕赤酵母基因组中AOX1醇氧化酶基因，2 000 bp对应Atpofut1(1 337 bp)和质粒pPICZαA上AOX1片段(582 bp)的总长(1 919 bp)(图3- C)，证明筛选到了正确的毕赤酵母阳性转化子。

选取正确的毕赤酵母转化子X-33/pPICZαA-AtPOFUT1诱导表达，甲醇诱导表达72 h时有较多诱导蛋白生成。超滤膜浓缩酵母发酵液上清后，用镍柱亲和层析纯化浓缩液，依次用10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L和100 mmol/L咪唑洗脱(图4泳道2～5)，在40 mmol/L咪唑浓度得到纯度较高的目标蛋白。

2.3 重组AtPOFUT1的活性测定

用纯化得到的酶液进行酶反应，以沸水浴10 min的失活酶作为空白对照，HPLC检测底物GDP-Fuc消耗。HPLC检测不同浓度GDP-Fuc标准品，确定该物质出峰时间为上样后12 min。对照组在12 min出现与标准品对应的峰，而在酶反应组中此峰消失(图5)，证明纯化得到的蛋白具有岩藻糖基转移酶活性，即AtPOFUT1具有预期的酶活力。

2.4 Atpofut1差异表达分析

利用现有公共芯片数据对Atpofut1的转录水平进行分析，对于揭示其重要的生物学功能具有很强的指导性。根据常见的能够对植物生长发育产生影响的胁迫环境，选取7种处理条件(物理损伤、高温、盐胁迫、寒冷、干旱、渗透压、植物激素)，分析Atpofut1在各种处理下表达水平的变化。

Atpofut1对部分处理条件有明显响应，总体来说，在寒冷、高温、盐胁迫、干旱和物理损伤(图6-A～E)下，Atpofut1表达上调；高渗透压、激素处理(图6-F、G)使Atpofut1表达下调。推测Atpofut1在植株中一定程度上参与抗逆抗病过程。

在某些处理条件下，Atpofut1的表达水平变化呈现出器官的特异性和时间的相关性。如高温处理30 min时(图6-B)，芽中Atpofut1表达显著下调，而1 h后芽和根中的Atpofut1表达均上调。推测在30 min～1 h，植物通过调控Atpofut1的表达来调控关键蛋白活性，从而使植物应对高温环境刺激。由此说明AtPOFUT1介导的O-岩藻糖基化在抗逆途径中发挥关键作用。

2.5 AtPOFUT1的缺失对拟南芥种子发育的影响

除草剂筛选的阳性植株移栽培养后提取DNA进行三引物PCR的验证。选取纯合子植株收取种子用于后续表型观测。

在相同条件下，种植纯合子突变体和野生型种子，观察幼苗表型发现突变体幼苗根形态正常，没有异常卷曲及根毛过盛或偏少(图7-A)，统计根长与野生型相比没有显著差异(图7-B)，下胚轴在显微镜下观察细胞形态与排列方式均与野生型相同(图7-C)。

突变体成株生长周期与野生型均无明显差异，花萼、花瓣、雌蕊、雄蕊等花结构完整，数量和形态均正常(图7-D)，但是果荚较野生型弱小。统计果荚长度突变体显著偏短，且有相当数量种子发育不良(图7-E～G)。

3 结论与讨论

本研究成功克隆了HsPOFUT1在拟南芥的同源基因Atpofut1，通过毕赤酵母异源表达获得了有预期岩藻糖基转移酶活性的重组蛋白AtPOFUT1。由此说明拟南芥中除了AtSPY这种植物特有的O-岩藻糖基转移酶之外[18]，还具有与其他后生动物同源的POFUT1。与AtSPY不同的是，AtPOFUT1很可能与后生动物一样，以含有EGF序列的蛋白作为底物[13]。虽然AtSPY与AtPOFUT1均具有O-岩藻糖基转移酶活性，但由于底物特异性不同很可能介导不同的生物学过程，具有不同的生物学功能。后续工作中，O-岩藻糖基修饰蛋白组的检测及相应底物谱的筛选研究对于揭示两者功能的差异至关重要。

Atpofut1的转录组分析印证了植物会通过调控该基因的表达来调控关键蛋白活性从而使植物对各种胁迫环境做出应答。在植株的表型观测中，与野生型相比，缺失Atpofut1的突变体幼苗发育、成株形态和花结构没有显著差异，但是存在果荚弱小、种子发育不良的特征。由于AtPOFUT1被证明在花粉管发育中有重要作用，种子和种皮的发育均与受精过程相关，该差异可能是由于授粉过程中花粉管发育不良造成的[19]。因此，Atpofut1不仅在胁迫环境下发挥作用，在生长发育中也有着非常关键的功能。O-岩藻糖基修饰蛋白组的筛选也能够帮助分析Atpofut1在生长发育和胁迫环境下的信号转导通路，进而揭示植物通过糖基化修饰调控生命活动的具体机制。