地钱部分MYB家族基因在不同发育时期、部位以及激素处理下表达量差异分析

高旭东，傅 晶，崔洪昌,2

(1.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100; 2.佛罗里达州立大学 生物科学系，塔拉哈西，佛罗里达，美国 32306)

MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)蛋白是一类数量庞大，功能种类繁多，存在于几乎所有真核生物的转录因子。MYB结构域较为保守，主要包含3个重复，每个重复由编码3个α-螺旋的50～53个氨基酸残基构成，其中第2和第3个α-螺旋形成螺旋-转角-螺旋(HTH)结构，可直接嵌入DNA的大沟，发挥转录因子的DNA结合结构域的功能[1]。根据重复区域的数目和排布，MYB蛋白可以分为不同的种类，具有单一MYB结构域的类MYB蛋白(R1/2或R3)、两种重复结构的2R-MYB蛋白(R2R3)、3种重复结构的3R-MYB蛋白(R1R2R3)以及4种重复结构的4R-MYB蛋白(R1R2R2R1/2)[2]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，MYB家族在植物体内激素合成，发育以及抗逆过程中都起到至关重要的作用[1]。

地钱(MarchantiapolymorphaL.)是一种苔纲，地钱科地钱属的孢子植物。其内部含有的黄酮类、联苄类、香豆素类和萜类化合物赋予了地钱在临床上较高的药用价值[3]。地钱在系统发生上位于莱茵衣藻和小立碗藓这两种模式系统之间，被誉为进化史上首次登陆的植物之一，其部分生理特征具有藻类植物所特有的特性。为了适应陆地生活，地钱还进化出了适应陆地环境的新特征[4]。近年来，随着地钱的遗传转化体系的建立以及其基因组测序的完成，这种基因组小、冗余基因少、易于培养繁殖、便于遗传操作的苔藓逐渐成为研究植物进化和基因功能的新兴模式系统[5]。鉴于MYB家族在植物发育与抗逆等方面的重要功能，在地钱中研究MYB家族基因的功能将有可能揭示植物在进化过程中适应陆地生活的 机制。

根据生物进化学及考古相关研究，植物从水生到陆生的过程发生在距今大约4.5亿年前[6]，而植物气孔的出现可追溯到距今约4亿年前[7]。在植物登陆过程中，需要面对非常多来自陆地环境的威胁，从紫外线照射到干旱胁迫都对早期陆生植物造成严峻挑战。控制植物体内水分的流失以及通过呼吸作用代谢能量就成为植物适应陆地生活关键性的功能，所以气腔(类似高等植物的气孔)的产生是地钱的一项重要革新。在高等植物中，MYB亚家族S28具有控制气孔细胞命运、抗干旱和冷害胁迫的功能[8-9]，因此选择与亚家族S28同源的地钱MYB基因作为研究对象。

在整个演化过程中，从较原始的苔藓植物以形成胞芽杯的形式无性繁衍，到后来的高等植物产生侧生的器官生成更多的后代，在适应陆地生活的过程中，侧生组织起到至关重要的作用。在拟南芥中MYB亚家族S14主要起到控制叶腋分生组织发育的功能[10-11]，而与S14同源的地钱MYB家族基因GCAM1(Mapoly0034s0034)具有调控胞芽杯发育的重要功能[12]，因此推测地钱中与GCAM1以及S14同源的MYB基因有可能与高等植物中侧生分生组织的进化具有联系，故选择S14的地钱同源基因作为研究对象。另一方面，拟南芥MYB基因AtCDC5在植物中起到调控细胞循环的作用，与维持茎尖分生组织有关，而其在地钱中的同源基因MpCDC5可能参与分生区的维持，所以也将MpCDC5选作目的基因。

通过构建拟南芥与地钱MYB家族(以R2R3-MYB为主)的系统进化树，同时参考前人研究[4,13]，最终选择MpR2R3-MYB20(Mapoly-0874s0001)、MpR2R3-MYB8(Mapoly0024s-0094)、MpR2R3-MYB3(Mapoly0007s0265)、MpR2- R3MYB18(Mapoly0123s0012)、MpR2-R3MYB16(Mapoly0092s0005)和MpCDC5(Mapoly0014s0195)6个基因作为目的基因，并对它们在地钱不同生长时期和组织部位中的表达量进行实时定量PCR分析。此外，前人研究表明，ABA能够在抗旱过程中调节气孔的导度以及调控胞芽杯的休眠[14-15]；外源施加较低浓度的IAA可以促进小立碗藓配子枝的形成及生长，同时还能明显促进原生质体细胞的再生及分裂[16]，0.5 μmol/L的IAA能够调节地钱的发育与胞芽的休眠[17-18]。鉴于此，在外源施加ABA和IAA处理下，检测这些基因的表达水平是否发生变化。

1 材料与方法

1.1 材 料

植物材料：地钱Takaragaike(Tak-1，雄性)和Takaragaike(Tak-2雌性)，由福建农林大学山室千鹤子教授实验室馈赠。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因的确定 使用拟南芥MYB转录因子S14(共6个基因)、S28(共2个基因)亚家族和地钱全部MYB家族(共60个基因)的氨基酸序列构建系统进化树。同时参考Bowman等[4]关于不同物种MYB家族进化树，选取拟南芥S14与S28亚家族同源的地钱MYB基因作为目的基因。

1.2.2 实时定量PCR引物设计 确定目的基因后，按照产物总长度150～250 bp进行引物设计，MpEF1a为内参基因。结果如表1所示，引物于北京奥科鼎盛生物公司合成。

表1 目的基因实时定量PCR引物信息Table 1 Informationof primers for qRT-PCR of target genes

1.2.3 地钱的培养与激素处理 地钱于恒温生长间培养(光照周期16 h光照，8 h黑暗；光照度 3 000 lx；室内平均温度22 ℃，平均湿度40%)，地钱生长于含1%琼脂的1/2 B5培养基中。

激素处理采取0.5 μmol/L与0.1 μmol/L的IAA(BBIlife science公司)以及20 μmol/L的ABA(SIGMA公司)进行试验，并于2周后取样，与无处理对照组比较，对目的基因表达量的变化进行测定，每个处理设置4个重复。

1.2.4 样品提取及保存 激素处理组使用Tak-2作为试验样品，其中每个处理组及对照组设置4个培养皿，平均每个培养皿种20个样品，于2周大小时分别选取其中2个长势类似的培养皿，取全株样，鲜质量约200 mg置于液氮中。组织特异性试验使用的地钱样品为Tak-1，每个不同样品分别种4个培养皿，每个培养皿种20个植株。取样分为2周分生区、2周中脊、2周全株、3周分生区、3周胞芽杯和胞芽，选取其中长势相同的2个培养皿取样，每个样品鲜质量约200 mg并置于液氮中。地钱不同组织部位见图1。

1.2.5 样品RNA提取、反转录及实时定量PCR 每个样品200 mg，使用液氮研磨后用Trizol(Takara公司的RNAisoplus，货号9109)提取RNA，反转录使用Takara公司的反转录试剂盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(货号6210A)进行cDNA第1链合成，产物稀释至100 μL用于qRT-PCR分析。

实时定量PCR使用试剂为Vazyme公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，货号Q711)，PCR总体积为20 μL，每个样品设置3个技术重复，使用MpEF1a基因作为内参进行对比分析。qRT-PCR反应程序为： 95 ℃预变性2 min，45个循环(95 ℃变性5 s，对应退火温度30 s)，最后添加1次溶解曲线分析。

1.2.6 数据处理 使用MpEF1a作为内参基因，组织特异性试验以Tak-1(雄性)为材料。计算相对表达量时，将每组中表达量最低的样品表达量设为“1”。不同激素处理以Tak-2(雌性)为材料，使用MpEF1a作为内参基因对6个目的基因进行qRT-PCR分析，对照组表达量设为“1”。使用Spss软件中的Duncan’s分析法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 地钱中S14、S28亚家族和 AtCDC5同源基因的确定

使用MEGA 7软件将地钱MYB与拟南芥MYB亚家族S14、S28以及AtCDC5基因的氨基酸序列共同构建系统进化树，结果见图2，确定MpR2R3-MYB20为S14同源基因，S28的同源基因则有MpR2R3-MYB18和MpR2R3-MYB3，AtCDC5同源基因为MpCDC5(GCAM1已有研究，主要功能是调控胞芽杯的发育[12])。这与Bowman等[4]的结果基本一致，但缺少S14亚家族的MpR2R3-MYB8和S28亚家族的MpR2R3-MYB16，推测可能与选取的MYB基因数目及构建系统树参数的差异有关。由于这两个基因可能与其他的S14和28亚家族基因功能相似，因此在试验中同时对它们进行分析。

2.2 6个基因时空表达结果

6个基因时空表达结果(图3)显示，MpR2R3-MYB20在胞芽中表达量最高，而胞芽杯表达量却较低，就2周结果而言，其分生区与中脊表达量较高，而全株却远低于前两者，推测此基因在叶状体中表达量低；MpR2R3-MYB8在2周与3周的分生区中高表达；MpR2R3-MYB18在胞芽杯中表达量最高，胞芽次之。基因MpR2R3-MYB16在全株以及中脊表达量较高，表明其可能在叶状体中高表达。相较于其他基因而言，MpR2R3-MYB3与MpCDC5的时空表达差异性较小，主要在3周左右的分生区中高表达。

2.3 激素处理后地钱生长表型变化

对地钱进行IAA和ABA两种植物激素处理，处理后的生长变化如图4所示。通过对每个培养皿平均约20至25个地钱的面积进行测量，得出对照组每个地钱样品平均面积约为0.95 cm2± 0.24 cm2，0.1 μmol/L IAA处理下平均面积约为0.97 cm2±0.30 cm2，0.5 μmol/L IAA处理下平均面积约为0.95 cm2±0.32 cm2，但IAA处理下地钱的假根明显增多，且随着IAA浓度增加，假根数量也随之增加。在20 μmol/L ABA处理下，地钱样品平均面积约为0.16 cm2±0.02 cm2，仅为对照组的16.8%，地钱生长状态受到明显抑制，假根数量无明显变化。

2.4 激素处理qRT-PCR结果分析

如图5所示，MpR2R3-MYB20在0.1 μmol/L IAA处理下表达量显著升高，其表达量相较于对照组上调7.89倍，其他处理差异不显著；MpR2R3-MYB8在两种激素处理下表达量均出现小幅下调；MpR2R3-MYB3在IAA处理下显著下调，0.1 μmol/L IAA处理相比0.5 μmol/L IAA处理下调幅度更大，但在20 μmol/L ABA处理下下降不显著；MpR2R3-MYB18在20 μmol/L ABA处理下出现显著上调。MpR2R3-MYB16在0.5 μmol/L IAA与20 μmol/L ABA处理下与对照组相比显著下调，而在0.1 μmol/L IAA处理下表达量显著上调；MpCDC5在IAA处理下下调显著，而在ABA处理下变化不显著。

3 讨 论

与藻类相比，地钱演化出陆地生活所需的气体交换、固着以及繁衍的一些基本组织结构和功能，被认为是最为原始的陆生植物，其基因组也处于一种“原始”状态。在之后的进化历程中出现的陆生植物大多经过全基因组倍增或多倍化过程，使这些结构和功能变得更为精细和完善。通过同源序列法寻找高等植物中控制相应结构和功能形成的相关基因在地钱中的同源基因，对这些基因在地钱中进行时空表达分析，能推测其在地钱中的作用，为阐释植物登陆的机制提供线索。

通过对MpR2R3-MYB8与MpR2R3-MYB20表达模式比较发现，虽然两者都是S14和GCAM1的同源基因，但表达模式却有较大差别。与GCAM1的亲源关系相对较远的MpR2R3-MYB8在分生区中高表达，而在2周的中脊表达最低，且受IAA和ABA的影响较小，而中脊正是地钱周期性形成胞芽杯的部位，因此推测其可能与胞芽杯的发育关系不大，具体功能有待进一步研究。与GCAM1的亲源关系较近的MpR2R3-MYB20，在胞芽、分生区和中脊表达量较高，与GCAM1的GUS染色得出的表达模式基本一致[12]，二者很可能功能冗余的调控胞芽杯的发育。另外，MpR2R3-MYB20受到0.1 μmol/L IAA诱导大幅上调，且在分生区较高表达，所以推测其功能与分生区细胞增殖有关。

拟南芥S28亚家族中的MYB124和MYB88通过抑制细胞周期蛋白CYCA2s来调节保卫细胞的分化[19]。在S28亚家族的同源基因中，MpR2R3-MYB3在分生区高表达外，在全株中也有较高表达，这表明MpR2R3-MYB3可能在分生区和中脊以外的叶状体部位有较高的表达，而MpR2R3-MYB16在叶状体中的表达也较高，这两个基因很有可能通过调控细胞周期蛋白来参与地钱气腔的形成。此外，在ABA处理下MpR2R3-MYB16表达水平出现大幅下降，推测其可能与S28亚家族的抗干旱寒冷胁迫类似[9]，在胁迫条件下出现与ABA协同调节气腔导度，而MpR2R3-MYB16在0.1 μmol/L IAA处理下显著上调，表明其功能可能与地钱发育相关。MpR2R3-MYB18在胞芽杯和胞芽中高表达，且受到ABA诱导上调最为明显，推测MpR2R3-MYB18可能与地钱适应陆地生活有关。此外，鉴于拟南芥中S28亚家族与细胞周期的关系以及ABA能调控胞芽杯的休眠，据此推测MpR2R3-MYB18可能通过ABA信号途径调控了胞芽杯与胞芽形成的起始过程。

MpCDC5在3周分生区表达最高，低浓度IAA处理后表达量显著下调。MpCDC5基因在拟南芥中的同源基因AtCDC5具有调控分生区细胞循环G2期到M期过渡的作用[20-21]，因此推测MpCDC5可能参与促进了分生区的形成，并且在IAA处理下出现下调以维持分生区稳定。

本试验通过对地钱中部分MYB基因在不同情况下表达量的差异进行分析，为日后在地钱中研究相关基因的功能进行铺垫，为进一步研究植物进化过程中适应陆地环境的机制提供思路。