致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like寄主靶标的酵母双杂交筛选

2021-02-06张晓将单卫星

西北农业学报 2021年1期

张晓将,成静,单卫星,杜羽

(1.西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)长期遭到卵菌病原物致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病的侵扰，晚疫病会危害马铃薯的叶片、叶柄、茎和块茎，严重威胁全球马铃薯生产安全[1]。卵菌是一类形态上类似真菌的真核微生物，在生化代谢、细胞壁组成以及繁殖方式等方面与真菌存在差异[2]。卵菌包括许多重要的植物病原菌，可侵染自然界的许多植物，引起多种毁灭性病害，如大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)引起的大豆根腐病[3]、橡树疫霉菌(Phytophthoraramorum)引起的橡树猝死病[4]等，严重危害农业生产安全。

致病疫霉菌通过分泌大量的效应蛋白干扰植物免疫反应，促进病菌对植物的侵染。其中 RXLR类效应蛋白在致病疫霉菌侵染植物过程中发挥重要的促进病菌侵染作用[5]。RXLR效应蛋白N 端含有一个信号肽和一段保守的RXLR基序(R：精氨酸；X：任意氨基酸；L：亮氨酸)，负责效应子的分泌和转运进入植物细胞；C端则是效应蛋白的功能域，决定效应蛋白的功能。

在植物-病原物长期的互作过程中，植物形成了一套有效的免疫体系来抵挡病原菌的入侵，同时病原菌通过进化和改变其效应蛋白组成，可以攻克植物的免疫体系以建立疾病。Jones和Dangl[6]提出的“zigzag”模型对植物-病原物的互作进行了总结。在马铃薯与致病疫霉菌复杂的防御和侵染互作过程中，RXLR效应蛋白起着非常关键的作用，这些效应蛋白进入宿主细胞并与寄主靶标结合，达到调节寄主免疫反应的目的，有些寄主靶标蛋白对植物抗性起正调控作用，在植物中增强此类蛋白的表达会提高抗性，如Sec5[7]、C14[8]等；有些靶标蛋白对植物抗性起负调控作用，这些蛋白在植物中增强表达会导致植物抗性降低，如PP1c[9]、StNRL1[10]等。

利用酵母双杂交技术筛选病菌效应蛋白寄主靶标，揭示病菌侵染机制的研究较多。Du等[7]通过酵母双杂筛选到致病疫霉菌效应蛋白AVR1的寄主靶标Sec5，发现AVR1与Sec5互作可以抑制INF1引发的坏死，推测AVR1可能通过靶向Sec5干扰植物细胞囊泡运输来调控植物免疫；Bos等[11]同样采用酵母双杂交技术研究发现效应蛋白AVR3a通过稳定其植物靶标E3连接酶CMPG1来操纵植物免疫；陈姗姗等[12]通过酵母双杂交筛选到辣椒疫霉效应蛋白RXLR19781的寄主靶标E2泛素连接酶，并验证两者之间的互作；Naveed等[13]通过酵母双杂交技术筛选到致病疫霉菌RXLR效应蛋白Avrblb2的寄主靶标CaM，研究发现Avrblb2通过与CaM相互作用来干扰植物中与Ca2+相关的防御机制。

致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like(AL)与AVR1高度同源，但AL不靶向AVR1的毒性靶标Sec5，也不抑制INF1引发的坏死，推测其毒性机理与AVR1不同[7]。为了揭示AL毒性作用机理，本研究运用酵母双杂交技术，对马铃薯晚疫病菌RXLR效应蛋白AL寄主靶标进行筛选和鉴定，为揭示效应蛋白AL的毒性机理提供基础，对进一步解析卵菌与寄主植物的互作机制有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

SD-Leu-Trp-Ade-His、X-α-gal、鲑鱼精DNA均购自TaKaRa试剂公司，2×YPDA、SD-Trp、SD-Leu、SD-Trp-Leu、SD-His-Leu-Trp均由蔬菜生物技术与种质资源创新实验室配制；pGADT7载体、pGBKT7载体、AH109菌株、Y187菌株、酵母文库、DH5α菌株购自Clontech公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，高保真DNA聚合酶Fast pfu DNA polymerase、限制性内切酶、T4 DNA Ligase等购自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 诱饵载体构建根据AL DNA序列设计1对含有EcoRI和BamHI酶切位点的特异引物(表1)，以致病疫霉菌菌株88069 DNA为模板，通过高保真DNA聚合酶PCR扩增得到AL诱饵片段，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、胶回收纯化，并与pGBKT7(BD)载体同时采用EcoRI和BamHI进行双酶切，采用T4 DNA Ligase将酶切过的PCR产物与载体进行连接，热激转化大肠杆菌感受态细胞，通过菌落PCR检测阳性克隆(引物序列见表1)，提取质粒并进行测序验证。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.2 诱饵载体自激活验证根据酵母手册(clontech)的方法，将诱饵载体AL-pGBKT7与空载质粒pGADT7共转化到酵母菌株AH109中，涂布在SD-Trp-Leu选择性培养基上培养2～3 d。挑取菌落到SD-His-Leu-Trp加X-α-gal及SD-Leu-Trp-Ade-His加X-α-gal的平板上进行互作验证，2～3 d后观察酵母生长情况。

1.2.3 酵母双杂交按照“1.2.2”的方法将诱饵载体转入酵母菌株AH109中，根据酵母手册(clontech)的方法进行酵母杂交，将重悬液均匀涂布在SD-His-Leu-Trp的培养基上28 ℃ 5～6 d；之后将酵母菌落在加有X-α-gal的SD-His-Leu-Trp平板上划线培养，筛选阳性克隆。利用pGADT7载体测序引物将阳性克隆进行酵母菌落PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，对目的条带进行测序，测序结果均通过National Center for Biotechnology Information(NCBI)比对进行分析。

1.2.4 酵母菌落PCR 在1.5 mL离心管中加10 μL ddH2O，将生长良好的阳性克隆挑至离心管中，封口膜密封，对酵母菌液进行6次反复冻融(液氮中15 s，水浴锅65 ℃ 1 min)，之后12 000 g离心10 s，用2 μL的模板进行PCR，PCR产物在10 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳，检测目的条带，对阳性结果的PCR产物进行测序分析。

1.2.5 酵母质粒提取将培养物全部转至2 mL离心管中，13 000 r/min 2 min；弃上清，用120 μL ddH2O重悬菌体，加入500 μmol/L的玻璃珠约120 mg，剧烈震荡2 min(每震荡30 s冰浴1 min)；14 000 r/min 2 min，上清转移至新的1.5 mL离心管；加入40 μL Tris-饱和酚，充分震荡混匀，室温静置10 min，加40 μL氯仿，充分震荡混匀，冰上静置10 min，12 000 r/min 10 min；上清液转移至新的1.5 mL离心管，加入1/2上清液体的7.5 mol/L的醋酸铵，加入1倍上清液体积的异丙醇混匀，-20 ℃放置2 h；12 000 r/min 15 min，弃上清，加入1 mL 80%的乙醇处理2 min，12 000 r/min 5 min；弃上清，超净台风干2 min，加20 μL ddH2O，测浓度，保存在-20 ℃。

2 结果与分析

2.1 诱饵载体构建

以致病疫霉菌88069菌株的DNA为模板，ALY2HEcoRIF、ALY2HBamHIR为引物扩增目的片段，扩增得到的片段大小与预期诱饵片段AL大小相同(441 bp)(图1-a)，利用胶回收试剂盒对目的基因进行回收，之后将目的基因和pGBKT7均用EcoRI和BamHI双酶切，pGBKT7已被线性化(图1-b)，将酶切好的目的基因与载体用T4 DNA Ligase进行连接，转化大肠杆菌，之后通过菌落PCR筛选阳性克隆，扩增出440 bp左右的目标条带(图1-c)，经测序分析诱饵载体AL-BD构建正确。

2.2 效应蛋白AL自激活的验证

将建构好的诱饵载体AL-BD与AD空载质粒用酵母共转化的方法转化到酵母菌株AH109中，涂布于SD-Trp-Leu培养基上，观察酵母菌落生长状况(图2-a)，2～3 d后将生长良好的酵母单菌落在加有X-α-gal的SD-Leu-Trp-His平板上进行互作验证，2～3 d后观察酵母生长的情况，发现与正负对照相比诱饵蛋白AL-BD不具有自激活活性(图2-b)。

2.3 诱饵载体在酵母菌中的检测

将构建好的AL-BD质粒转化到酵母菌株AH109中，涂布于SD-Trp固体缺陷型培养基上，观察酵母菌落生长状况(图3-a)，2～3 d后挑选直径约2 mm的酵母菌落进行菌落PCR检测，以AL-BD质粒为阳性对照，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，酵母菌落1-8均有条带且与目标条带大小相同(图3-b)，说明AL-BD质粒成功转入AH109中。

2.4 效应蛋白AL寄主靶标的筛选

以西北农林科技大学茄科作物抗疫病基础研究实验室构建的晚疫病菌侵染12 h后的番茄cDNA酵母双杂文库为材料，用效应蛋白AL-BD为诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术筛选AL的寄主靶标，最后涂布在SD-Leu-Trp-His的缺陷型培养基上，5～7 d后将生长良好的酵母菌落在SD-His-Leu-Trp + X-α-gal的缺陷型培养基上划线培养(图4-a)，将阳性克隆进行酵母菌落PCR检测(图4-b)，将有条带的PCR产物送测序分析，挑取22个阳性克隆，其中AL-8、AL-11、AL-14、AL-16、AL-18为单条带直接将PCR产物送测序；AL-6、AL-9、AL-13、AL-15、AL-17、AL-19为多条带，其余没有条带。

对AL-6、AL-9、AL-13、AL-15、AL-17、AL-19为多条带的及没有条带但在SD-His-Leu-Trp+X-α-gal平板上生长良好变蓝的菌落选择采用SD-Trp-Leu液体培养基进行摇菌培养，之后提取酵母质粒，转化大肠杆菌并进行阳性克隆的检测(图4-c)，对有条带的提取大肠杆菌质粒，并采用pGADT7的通用正向引物进行测序分析。

最终获得AL的候选靶标，其中还包括热休克蛋白同源蛋白、单脱氢抗坏血酸还原酶、过氧化物酶体蛋白等(表2)。

表2 AL的候选互作蛋白Table 2 Candidate interacting proteins of AL

2.5 AL与候选靶标的初步互作验证

为了进一步验证候选靶标与效应蛋白的互作，将阳性克隆进行摇菌提取酵母质粒，通过大肠杆菌纯化质粒后将质粒分别与诱饵蛋白AL-BD和BD空载共转入酵母菌株AH109，在SD-Leu-Trp-His+X-α-gal上进行点板验证，查阅文献选择AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6、AL-7进行互作验证，发现在SD-Leu-Trp-Ade-His+X-α-gal上，与正负对照相比AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6与AL-BD强互作且无自激活，AL-7与AL-BD弱互作且无自激活(图5)。

3 讨论

RXLR效应蛋白通过靶向植物蛋白来调控寄主免疫。目前只有极少数的RXLR效应蛋白寄主靶标被发现[14]。通过对效应蛋白寄主靶标的筛选与鉴定，能够为揭示效应蛋白的毒性机理提供基础，对进一步解析卵菌与寄主植物的互作机制有重要的意义。本研究采用酵母双杂交的方法对晚疫病菌RXLR效应蛋白AL的寄主靶标进行筛选和鉴定。首先构建AL-BD载体，并对AL-BD构建的自激活活性进行鉴定，证明AL-BD不存在自激活活性，可以进行酵母双杂交筛选。研究还对转化AL-BD载体的酵母进行酵母菌落PCR鉴定，证明AL-BD成功转化到酵母菌株AH109中。之后通过酵母双杂交筛选，初步得到12个候选互作蛋白，通过查阅文献分析候选互作蛋白的功能，发现Al-1以及AL-8、AL-9、AL-10、AL-11和AL-12与植物免疫无关，推测其可能为假阳性互作蛋白。因此，选择AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6、和AL-7进行初步互作验证。结果显示AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6与AL-BD强互作，AL-7与AL-BD弱互作(图5)，候选互作蛋白均无自激活现象。研究表明AL-2、AL-3、AL-4、AL-5、AL-6、AL-7均为AL的候选寄主靶蛋白。由于酵母双杂交技术存在一定的假阳性结果[15]，需要通过例如蛋白质免疫共沉淀、双分子荧光互补、蛋白体外pull-down等其他蛋白质互作技术对候选靶标与AL的互作进行进一步的鉴定。

AL-3编码一个过氧化物酶体蛋白，有研究表明葡萄霜霉菌(Plasmoparaviticola)RXLR效应蛋白RXLR10可以靶向植物过氧化物酶蛋白VvP42，在转录水平抑制其表达进而抑制植物的PTI反应，从而调控植物免疫[16]。本研究筛到的过氧化物酶体蛋白可能也参与调控植物免疫，在致病疫霉菌RXLR效应蛋白AL发挥毒性的过程中发挥重要的作用。AL-4编码的热休克蛋白(HSP70)，研究表明沉默热休克蛋白可以抑制不同病毒对本氏烟草的感染，具有负调控植物免疫的作用[17]。关于HSP70调控卵菌侵染的机制尚未有明确的研究，因此筛选到的热休克同源70 ku蛋白(heat shock cognate 70 ku protein 2-like)在卵菌侵染过程中的功能以及效应蛋白AL是否依赖其发挥毒性作用还有待进一步研究。AL-6编码的单脱氢抗坏血酸还原酶蛋白(MADR)、AL-2编码的ABC(ATP binding cassette)C家族转运蛋白、AL-5编码的Zeta类谷胱甘肽s-转移酶类蛋白(GSTZs)以及AL-7编码的磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶蛋白(PIP5K9)，主要参与植物根系、果实的生长发育、细胞增殖等过程[18-21]，效应蛋白可能通过影响植物的基础代谢、生长发育等过程来降低植物免疫力，从而促进病原菌侵染。

此外，由于效应蛋白可能通过靶向不同寄主靶蛋白，利用不同的机理调控植物免疫[22-23]，因此针对候选靶标还需要进行进一步抗、感病功能鉴定，确定其是否参与植物抗感病过程；通过进一步分析AL毒性功能是否依赖与靶标蛋白的互作，最终才能确定AL真正的靶标蛋白，并揭示AL的毒性作用机理。本研究为进一步分析AL靶标的抗、感病功能和进一步解析AL毒性作用机理奠定基础。