脂肪酶在白酒酯类化合物合成中的作用研究进展

范光森，吴秋华，刘朋肖，富志磊，朱宇婷，成柳洁，杨 然 李秀婷*

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学 北京100048 2 北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京工商大学 北京100048 3 北京工商大学食品与健康学院 北京100048）

白酒是颇具中国传统酿造特色的酒精饮品，因风味独特而成为世界蒸馏酒的典型代表之一。自建国以来，我国白酒产业一直处于快速增长阶段，虽2018年产量有所降低，为871.20 万kL，但销售收入仍处于较高水平，为5 363.83 亿元，是食品饮料板块中的领跑者，占整个食品饮料的50%以上[1]。传统酿造工艺改造和技术革新一直是推动白酒产业发展的内在动力：上世纪五六十年代完成的白酒试点研究，确定了浓香型大曲酒的主体香气成分是己酸乙酯，全面提升了浓香型白酒的品质；七十年代实行的白酒机械化改革，以及八九十年代气相色谱技术的应用，先进勾调技术的建立，极大地加快了白酒产业的现代化进程。进入本世纪尤其是2010年之后，我国白酒产业增速却逐步放缓，其表观原因在于传统酿造工艺存在生产周期长，效率较低，品质稳定性差，大规模工业化生产难以实现等问题，究其实质则是由于我国传统酿造工艺过程众多层面的机理尚未明晰，许多关键的科学问题仍未解决，导致有着悠久历史的传统酿造工艺技术的传承和工艺革新均陷入了瓶颈，严重影响和制约了酿造白酒产品的品质提升和产业升级[2]。深入研究并探索传统白酒酿造过程所蕴含的深层次科学问题，厘清影响和阻碍传统酿造白酒工艺传承并实现技术革新的关键因素，寻求提升产品品质、推动传统白酒酿造产业升级的途径势在必行。

众所周知，白酒主体成分是水和乙醇（约占总重量的98%），然而决定白酒品质和风格的物质却是仅占总量1%～2%的微量呈香呈味成分[3]。这些成分包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、杂环化合物、含氮化合物等，其中，酯类化合物是白酒中种类最多、含量最高的一类风味化合物，据报道其种类多达500 余种，含量占白酒风味成分的75%～95%[4]。这些具有水果香、花香和甜香气味的酯类化合物，不仅赋予了白酒独特的芳香气味，影响甚至决定了白酒感官和品质的优劣，而且由一定量的酯类化合物作为呈香成分，也是传统酿造白酒区别于其它类型蒸馏酒的最显著特色之一[5-6]。基于酯类化合物是影响并决定酿造白酒风味和品质的关键化合物，关注并探讨其在酿造过程中形成的影响因素和产生机制，对于提高酿造过程品质的稳定性，提升产品品质，推动传统白酒酿造产业的现代化进程，具有重要意义。

1 传统白酒中酯类化合物形成的途径

我国白酒采用固态发酵模式酿造，经窖池发酵、甑桶蒸馏、陶坛贮存等工序制成，在这一过程中（单一或多种）原料经过成千上万种微生物错综复杂的分解、合成和转化等代谢作用，最终形成了上千种决定白酒品质和香型的风味物质，从而造就了不同风格的白酒[4]。对白酒品质具有重要意义的酯类化合物也是在这一过程中形成的。从白酒酿造的整个过程分析，白酒中酯类化合物的形成可能存在于以下3 个途径（图1）：1）原料带入；2）发酵过程或蒸馏过程的高温促进酸-醇自身发生化学反应产生；3）发酵过程酶法催化酸-醇酶促反应产生[7-8]。事实上，白酒中酯类化合物的合成确实是上述3 个途径共同作用的结果。

1.1 原料带入白酒中酯类化合物

白酒酿造所用原料均为谷物果实，其在生长过程中自身会形成部分酯类化合物，另外，白酒酿造过程中加热处理谷粒也会产生部分酯类化合物。如大米与糠壳中含有的γ-壬内酯，2、3-二甲基-2-壬烯γ-内酯具有甜而浓重，香气温和的特点；小麦中含有少量的乙酸乙酯；大麦中的内酯类化合物等[9]。

1.2 酸-醇非酶促自身化学反应形成白酒中酯类化合物

白酒酿造过程是一个复杂而漫长的过程，在这一过程中会产生众多化学物质，不乏会产生大量的酸类化合物和醇类化合物。事实上，除了酿造过程中微生物代谢作用产生大量的酸类化合物和醇类化合物外，在原料中也会存在大量酸类和醇类化合物[9]。这些酸类化合物和醇类化合物会伴随着蒸粮、发酵过程中温度的升高以及蒸馏过程而发生酸-醇酯化反应，从而生成对应的酯类化合物，由此可见，酸-醇非酶促自身酯化反应也是白酒酯类化合物形成的途径之一[9]。而相关研究表明，白酒中酯类化合物主要是在发酵过程中产生的，而这一过程中温度相对较温和，不利于酸类化合物和醇类化合物自身发生酯化反应，反应比较缓慢，而且还会伴随酯类化合物的分解反应。通过这一过程需要相对较长的时间才能形成酯类化合物，因此，白酒酿造过程中酸-醇发生化学反应形成酯类化合物是相对较少的，也非白酒中酯类化合物形成的主要途径[10]。并且，研究表明，白酒在贮存过程中发生更多的是酯类化合物的降解作用，尤其是在低度白酒中这种作用更为明显[11-12]。

1.3 酯化酶催化酸-醇酯化形成白酒中酯类化合物

图1 白酒酿造过程及其酯类化合物合成途径Fig..1 Baijiu brewing process and its ester compound synthesis pathway

高粱等白酒酿造原料是天然的富淀粉培养基，极易滋养大量微生物，基于此，在白酒酿造过程中，利用高粱等原料网络环境中的微生物，并在特殊环境条件的胁迫下（有氧-微氧-厌氧环境的转变，适宜的水分等）进行有规律的演替变化，通过成千上万种微生物的共同发酵作用，使原料经过微生物交互的代谢作用转化为含有各种风味成分的酒饮料[4]。由于白酒酿造原料、工艺和环境的差异，引起酿造菌群结构和代谢过程的不同，这也正是造成不同香型白酒中酯类化合物的种类和含量不同的重要原因，由此可见微生物代谢是白酒酿造的核心，而微生物代谢的实质是各种酶催化不同底物的生化反应，因此酒醅中微生物分泌的各种酶是酿酒中各种物质转化的动力，直接影响到香味物质的种类和数量[10，13]。针对白酒中酯类化合物的形成而言，除了上述所提及的原料带入和蒸馏等过程形成的少量酯类化合物外，大量的酯类化合物则是在酒醅发酵过程中，首先由微生物产生的生物酶通过对原料组分进行分解、合成和转化等复杂步骤产生酸类和醇类化合物，再经微生物产生的酯化酶催化酸-醇发生酶促酯化反应产生[9-10]。由此可见，凡是与产生酸类和醇类化合物及其衍生物相关的酶和酯化酶都会影响着酯类化合物的形成。在这些与酯类化合物合成相关的酶系中，脂肪酶因其优越的酯化能力而发挥着举足轻重的作用，是酯化酶系中的重要成员，已有研究证明脂肪酶对白酒中酯类物质的合成起到重要作用[10，13-20]，如采用灰色关联度分析白酒酒醅发酵过程中的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和脂肪酶与酯类化合物生成量之间的关系，结果表明脂肪酶对白酒酯类化合物的合成起到最重要的作用，并且已有研究将脂肪酶用作提酯增香的添加剂，应用于白酒或强化发酵复糟酒进行增香，取得了一定成效[16-18]。

综上可见，白酒中酯类化合物的形成是以上3 种途径共同作用的结果。虽然白酒酿造所用原料带入的酯类化合物在种类和数量上有限，但确是白酒酿造中酯类化合物合成的关键之一，这主要是因为原料组成成分会从源头上影响到白酒酿造过程中的微生物菌群结构，继而影响到酿造过程中的酶系组成和代谢途径，从而对白酒中酯类化合物种类和数量产生影响；而后两者的根本区别在于是否有酶参与反应，众所周知，白酒中的绝大部分化合物都是在发酵过程中产生的，酯类化合物也不例外，而这一过程温度相对温和，酸-醇自身酯化反应生成的酯类化合物含量相对较少，更多的酯类化合物则是借助发酵体系中的脂肪酶等酯化酶的酶促反应产生。由此可见，脂肪酶等酯化酶的酶促反应是白酒酯类化合物形成的主要途径，而原料的组成对其白酒中酯类化合物的形成发挥着关键性作用，酸-醇自身酯化反应是白酒酯类形成的补充。

2 脂肪酶及其催化酯类化合物合成机制

2.1 脂肪酶

脂肪酶（EC 3.1.1.3，lipase），又名三酰甘油酯水解酶，是一类丝氨酸水解酶，可以水解甘油三酯生成甘油二酯、甘油一酯、脂肪酸和甘油，其含有一个特殊的保守氨基酸序列（G-X1-S-X2-G，G代表苷氨酸，S 代表丝氨酸，X1 代表组氨酸，X2 代表谷氨酸或者天冬氨酸）。在非水相体系中，脂肪酶还可以催化酯化、酯交换（酸解）和转酯（醇解），甚至氨解反应[21]。脂肪酶来源广泛，古菌、细菌、真菌以及动植物都能产生丰富的脂肪酶，其中微生物来源的脂肪酶由于其酶学特性更为突出，能适应更多应用条件，因此应用更加广泛，是目前商品化脂肪酶的重要来源，更是白酒中酯类化合学形成的酶促动力源。

2.2 脂肪酶催化酯类化合物合成机制

目前有关脂肪酶催化酯类化合物合成机制的研究主要集中于有机相体系[22]。自Zaks 和Klibanov[22]首次报道了脂肪酶在有机相介质中酶学催化的特性后，有关其在有机相的催化特性和应用一直成为其研究热点。虽然不同来源的脂肪酶序列存在明显差别，但是行使催化活性的序列一般是比较保守的，催化中心三联体氨基酸残基序列一般为Ser-Asp-His，其中Ser 是亲核残基，位于脂肪酶的Gly-X1-Ser-X2-Gly 保守五肽序列中间，而保守五肽序列中的Gly 残基在脂肪酶的催化过程中主要起到增加保守区域的柔韧性，减少空间位阻的作用，以使底物能与酶催化中心更好地结合[23-24]。研究表明，脂肪酶催化酯类化合物的合成是一个可逆过程，该过程主要可以分为4个阶段[25-27]：（1）底物结合阶段：脂肪酶α-螺旋“盖子”结构打开，露出一个大的疏水表面，底物通过这个表面进入酶的催化活性中心，激活活性中心Ser 残基（图2a）；（2）中间四面体瞬时过渡态阶段：Ser 残基的-OH 氧原子促使羰基双键断裂，羰基的氧原子携带上氧阴离子，羰基的碳原子则与3 个其它原子结合，形成一种四面体瞬时过渡态复合物（图2b）；（3）共价中间体阶段：羰基上碳原子的四面体复合物不稳定，自身会螺旋扭转形成螺旋状的大偶极，氧阴离子则与另外2 个肽键的-NH-之间形成氧阴离子洞，在这一变化过程中，His 残基携带的质子会传递给酯键的醇羟基，从而释放出醇，然后羰基与质子化的Ser 残基形成新的酯键，构成稳定的共价中间体（图2c）；（4）酰基释放阶段：Ser 残基上的质子通过His 残基传递到酯键的醇羟基，然后His 残基从活性中心的水分子中争夺质子，水分子剩余的-OH 则攻击与Ser 残基的羟基共价结合的底物羰基碳原子，同时His 残基再将从水中获得的质子转移给Ser 残基的氧阴离子，释放酰基化合物（图2d）。然而也有极少数脂肪酶不具有“盖子”结构，使得酶的催化活性中心可以直接与底物结合，进行催化[28-29]。

当前，有机相体系中脂肪酶的催化机制研究普遍认为，当脂肪酶处于水相和有机相两相界面时，脂肪酶的α-螺旋“盖子”结构可以绕着连接该结构上的铰链进行翻折进而打开，暴露出下方的Ser-His-Asp 三联体活性位点，从而使底物能够与活性位点相结合实现酯类化合物的催化合成[30]（图3）。影响脂肪酶催化酯类化合物合成的因素有很多，就其本身结构来看，主要包括：①α-螺旋“盖子”结构，主要影响到底物与活性中心的接触；②氧阴离子洞，能够稳定催化过程中的中间体过渡态；③活性中心，是行使催化的核心；④Ca2+，激活活性因子和维持结构稳定[31]。这些结构位点或区域也正是众多探究脂肪酶催化特性策略的主要侧重点，尤其是与上述4 个催化合成过程相关的第（1）和第（3）阶段相关的位点常成为揭示脂肪酶底物特异性和产物特性机制的落脚点（图3）。Yadav 等[32-33]研究了脂肪酶Novozym SP 435 在庚烷体系中催化异丁酸与正丁醇酯化合成丁酸四氢康酯的反应动力学，结果表明该脂肪酶在非水相体系中催化酯类合成的反应动力学符合 “Ping-Pong Bi-Bi”机理（图4），即：脂肪酶既可与脂肪酸反应形成脂肪酶-酸复合物E.A，也可与醇结合形成惰性脂肪酶-醇复合物E.B，复合物E.A 进而转化为羧酸-脂肪酶中间体EAc 并释放出水P，随后EAc 与醇作用生成另一个二元复合物EAc.B，最终释放出酯类化合物Q 与游离酶E（图4）。

图2 脂肪酶催化酯类化合物的合成机制[26-27]Fig.2 Mechanism of esters synthesis catalyzed by lipase[26-27]

图3 典型脂肪酶催化反应的关键因素分析[30]Fig.3 Analysis of key factors in typical lipase catalytic reaction[30]

图4 脂肪酶催化酯类化合物合成的动力学反应Fig.4 Kinetic reaction of esters synthesis catalyzed by lipase

3 脂肪酶在白酒酯类化合物合成中的研究现状

白酒中酯类化合物的来源，包括原料带入，酿造和蒸馏过程缓慢的酯化反应，以及酶的酯化催化。业界普遍认为，酶的酯化催化是白酒中酯类化合物的主要形成途径，其中，脂肪酶是参与酯化催化的关键酶之一。表1总结了当前有关脂肪酶在白酒酯类化合物合成中的研究进展。从表中首先可以确定脂肪酶对于白酒中酯类化合物合成确实发挥了非常重要的作用，其次，有关脂肪酶对于白酒酯类化合物合成的重要性并不是现在才提出的，其实早在上世纪90年代，老一辈科研工作者早就已经意识到脂肪酶对于白酒品质的重要性，并且也开展了大量的工作，这些工作对于促进我国白酒品质的提升做出了很大贡献，同时也为现在的研究打下了坚实的基础，提供了科学的研究思路，然而由于当时科研水平的限制，一些具有酯类化合物合成相关的功能菌株未作详细的分类和鉴定；再次，在这些研究中霉菌和酵母或是来源于这些功能微生物的脂肪酶对白酒中酯类化合物形成作用尤为突出，很少有关细菌或其来源的脂肪酶在白酒提酯增香中应用的报道；另外，近几年，随着分子生物技术和酶技术的发展，以及科研工作者对于白酒研究的再次重视，随着研究思路的扩展，脂肪酶对于白酒中酯类化合物形成的重要性再次引起关注，同时也引起了国际大型酶制造企业的重视，脂肪酶在白酒提酯增香方面的应用，将会成为脂肪酶应用新的竞争点；目前，虽然已经积累了一些有关脂肪酶在白酒酯类化合物合成方面的研究，但这些研究仅限于菌株的筛选和初步的应用，缺乏内在的酶催化作用机制的研究，在一定程度上阻碍了脂肪酶在白酒提酯增香方面的应用。

从当前有关脂肪酶在白酒提酯增香方面的应用现状来看，主要分为2 种途径：（1）利用产脂肪酶的功能微生物；（2）利用脂肪酶酶制剂。这2 种途径虽然实质上相同，但由于所采用的方法不同，在实际应用过程中也会存在一些差异。直接利用产脂肪酶的功能微生物，尤其是这些微生物本源于对应的酿造体系，在实际应用中可以根据实际酿造情况和条件进行调节，并且这些功能微生物可以从引入之后一直到蒸馏前都发挥着重要的作用，很适合应用于我国传统白酒酿造过程中，如可以在大曲制作过程中加入制作酯化强化大曲，也可以同大曲一起按照一定比例混入到酒醅中，或是在酿造的某一阶段中加入。而直接使用脂肪酶虽然不能同使用微生物这样在整个酿造过程中都持续发挥作用（存在酶失活问题），但可以在特定时间进行强化，尤其是在发酵后期或是蒸馏前。另外，可以使用脂肪酶生产酯化液，通过白酒酿造体系外制备酯化液，然后根据白酒酿造情况灵活调整（这一方法的使用在当前白酒酿造标准体系下还存在争议，有待白酒酿造在传承的基础上创新和发展），从而较少引起酿造过程中微生物菌群结构的变化。然而无论采用哪种方法，同样还存在一些问题，如在酿造的哪个环节加入（制曲、发酵前、发酵过程中、发酵后、蒸馏）？ 以何种方式加入（与原料混合，喷洒表面，单独强化剂，与酒曲混合，制备强化酒曲）？ 加入的比例是多少？ 加入之后将会带来哪些变化（菌群结构，发酵酿造历程，酒醅中的风味物质）等。这些问题的系统解决有利于进一步提高白酒生产效率，提升白酒品质，同时加大推动白酒酿造的创新。

4 结论与展望

酯类化合物是白酒中重要的风味物质，其含量对于白酒品质具有重要影响。已有研究表明，脂肪酶对于白酒酿造过程中酯类化合物的形成发挥了关键作用，深入研究脂肪酶及其产酶微生物在白酒中的应用规律有利于进一步推动白酒的发展。自上世纪90年代起，有关脂肪酶对白酒中酯类化合物合成的研究就一直受到从事白酒工作研究者的关注，也做出了突出贡献，以下问题仍值得探究：

1） 白酒酿造是开放环境，不但有霉菌和酵母菌参与，细菌在酿造过程中也大量存在，其丰度甚至超过酵母菌和霉菌。然而，已有文献大多集中于霉菌和酵母菌产脂肪酶对白酒酯类化合物的研究，对细菌脂肪酶的研究非常有限，因此，有必要加强细菌来源脂肪酶在白酒酯类化合物合成作用的研究。

表1 脂肪酶在白酒酯类化合物合成中的研究Table 1 Research progress in lipase for synthesizing of esters in Baijiu

（续表1）

2） 根据资料，脂肪酶在有机相中对酯类化合物的合成转化率比较高，而在白酒实际生产过程中，属于水相体系，而这种体系并不利于脂肪酶高效催化酸和醇合成酯，导致在白酒酿造过程中酯类化合物生成缓慢且含量十分有限。由于脂肪酶在不同催化介质中的催化机制存在差异性，虽然脂肪酶在有机相介质催化酯类化合物合成的机制已趋明确，但水相介质的酯类化合物的形成过程仍需要探究验证。由此，若要明晰酿造过程中白酒酯类化合物形成的影响因素和产生机制，只有通过在水相体系中，深入探究脂肪酶影响酯类化合物合成的过程，从而探讨脂肪酶对于酯类化合物合成的催化机制，研究其内在关联并揭示白酒酯类化合物的合成机制，对于保障白酒酿造中酯类化合物的稳定合成，阐释传统酿造机制，具有重要理论意义。

3） 白酒酿造是一个多微共酵的过程，在这一过程中，有成千上万种微生物进行着错综复杂的代谢，时时刻刻发生着交联的生化反应，在特殊的白酒酿造条件下，这些反应最终形成了特定品质的白酒。随着分子生物技术、云计算、宏基因组、转录组、代谢组学等多组学技术的发展，能否通过大数据分析，从这繁复的过程中抓住酯类化合物合成的关键功能微生物，厘清关键的代谢途径，通过优化关键功能微生物的多元组合，合理调控发酵过程中的相关参数，定向调控白酒酯类化合物的合成。