基于电子鼻和电子舌技术评价乳酸乳球菌对发酵乳风味品质的影响

任 敏，多拉娜，王 帅，李 敏，杨成聪，孙志宏，孙天松

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室 呼和浩特010018）

发酵乳制品尤其是酸奶，凭借其独特的风味和丰富的营养物质深受广大消费者的喜爱。风味作为评定酸奶感官品质重要的属性之一，主要受到酸奶发酵剂菌种德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌产生的乳酸以及各种挥发性有机芳香类化合物的影响[1-2]。Çelik[3]认为由发酵剂代谢产生的乙酸、丁二酮、乙偶姻、乳酸和挥发性脂肪酸这5种物质是影响酸奶风味的关键性物质[4-5]。由此可见，发酵剂菌株的发酵特性对生产高品质酸奶至关重要。

乳酸乳球菌是乳球菌属中最具代表性的菌种，其2 个亚种（乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种）凭借优良的产酸、产香等特性，已经广泛应用于奶酪、发酵乳以及酸菜等产品的生产中[6]。在产酸特性方面，大量基因组研究结果证实乳酸乳球菌有着完整的乳糖代谢通路[7-8]，它们通过磷酸转移酶系统或透性蛋白实现乳糖的降解并产生乳酸。自然发酵乳制品是乳酸乳球菌的良好来源，然而，许多研究发现从自然发酵乳制品中分离得到的乳酸乳球菌产酸能力存在显著差异[9-10]。Gutiérrez-Méndez 等[11]研究表明乳酸乳球菌的产酸能力与蛋白水解能力存在相关性。其它研究还发现发酵产生的乳酸能够调节酪蛋白水解，进而影响产品风味[12]。目前关于不同发酵特性，包括产酸、蛋白水解能力的乳酸乳球菌与发酵乳滋气味关系的研究鲜有报道。

本研究采用电子鼻和电子舌技术对191 株分离自传统发酵乳制品中的乳酸乳球菌所制备的发酵乳进行滋气味评价，旨在获得不同发酵特性菌株与发酵乳滋气味之间的关系。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

191 株乳酸乳球菌均由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库提供，详细信息见表1。

1.2 主要试剂与设备

全脂乳粉，新西兰恒天然；M17 液体培养基、M17 固体培养基，英国Oxoid 公司；PBS 缓冲液，天津市大茂化学试剂厂；电子舌所需内部溶液、参比溶液、阴离子溶液、阳离子溶液和味觉标准溶液，日本Insent 公司。

PEN3 电子鼻：配备10 个金属氧化传感器，德国Airsense 公司；SA 402B 电子舌：配备5 个味觉传感器和2 个参比电极，日本Insent 公司；Eppendorf Centrifuge 5810 高速冷冻离心机，德国Ep-pendorf 公司；LRH-250 恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；ZHJH-C1214C 无菌工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；Vortex-genie 2 漩涡振荡器，美国Scientific Industries 公司；TW-PB3X5L水浴槽，上海沃迪自动化装备股份有限公司；SRH 60-70 高压均质机，上海申鹿均质机有限公司。

表1 191 株乳酸乳球菌菌株信息Table 1 Information of 191 Lactococcus lactis

（续表1）

1.3 试验方法

1.3.1 发酵乳的制备 将191 株乳酸乳球菌活化至第3 代，其培养液采用梯度稀释法进行活菌计数。全脂复原乳经均质、杀菌后，按106CFU/mL 的接种量接入菌体，30 ℃发酵至pH 4.6，将发酵乳置于4 ℃后熟24 h 后用于滋气味的测定。同时，记录发酵时间，测定0 h 及发酵终点的滴定酸度以及游离氨基氮（FAN，mmol/L） 含量，计算产酸速率（Δ°T/h）以及蛋白水解度。

1.3.1.1 产酸速率的测定 pH 值的测定使用精密pH 计。滴定酸度的测定方法依据国标GB5009.239-2016[13]。

产酸速率（Δ°T/h）=（发酵终点滴定酸度-发酵起点滴定酸度）/发酵时间[14]

1.3.1.2 蛋白水解度的测定 本研究采用邻苯二甲醛法（OPA） 测定发酵乳0 h 以及发酵终点的FAN 含量，通过其变化值来衡量菌株的蛋白水解程度[15]。

蛋白水解度（ΔFAN，mmol/L）=发酵终点FAN含量-发酵起点FAN 含量

1.3.2 电子鼻对发酵乳的测定 取发酵乳样品10 mL 两倍稀释后置于120 mL 样品瓶中使用电子鼻进行气味检测，采用10 个金属氧化传感器测定不同敏感物质类型。每隔1 s 测定一个响应值，共测定60 s。响应值在45 s 后达到稳定，选择49，50，51 时的响应值为测试原始数据[16-17]。

1.3.3 电子舌对发酵乳的测定 取发酵乳50 g，按照1∶3 加水稀释，10 000×g 离心10 min 后取上清液抽滤备用。将100 mL 发酵乳上清液均匀的倒在品杯中进行样品测定[18]。每个样品测定4 个平行值，选取后3 次测定值作为原始数据，以减少系统误差[19]。

1.4 统计分析

使用主成分分析法（Principal component analysis，PCA） 对发酵乳整体滋气味品质进行分析；使用Mann-Whiney 分析确定与发酵乳滋味品质差异显著相关的指标，通过Spearman 相关性分析确定各指标之间的相关关系。使用R 语言进行Mann-Whiney 以及Spearman 相关性分析，使用SAS 9.0 进行主成分分析，使用Origin 8.6 以及GraphPad Prism 6 软件进行数据可视化。

2 结果与分析

2.1 菌株的产酸速率以及蛋白水解程度分析

乳酸乳球菌能发酵牛奶中的乳糖等碳水化合物生成乳酸和一些有机酸，在降低发酵乳pH 值的同时赋予发酵乳良好的滋气味。而产酸能力不同的菌株对发酵乳最终的品质有重要影响。刘文俊[5]认为酸奶发酵是一个动态的过程，产酸速率可以反映整个发酵过程中菌株的产酸特性，宋宇琴[14]也将产酸速率的快慢作为衡量保加利亚乳杆菌产酸能力的指标之一。本研究团队先前已测定了供试菌株的产酸能力（图1a），191 株乳酸乳球菌的产酸速率范围在1.70～6.88 Δ°T/h[20]。参考刘文俊[5]、宋宇琴[14]的方法将191 株乳酸乳球菌分为3 组，分别为慢速产酸菌株72 株（S 组，产酸速率＜3.5 Δ°T/h）、中等产酸菌株71 株（M 组，3.5 Δ°T/h≤产酸速率≤4.5 Δ°T/h）和快速产酸菌株48 株（F 组，产酸速率≥4.5 Δ°T/h），方差分析结果表明3 组菌株之间的产酸速率存在极显著差异（P＜0.01）。

发酵乳样品中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白，乳清蛋白中含有非蛋白氮，即可溶解于三氯乙酸（TCA）的部分含氮化合物，因此采用OPA 法测定191 株菌在发酵期间FAN 含量的变化，进而评估乳酸乳球菌的蛋白水解能力[21]。同样的，本研究团队在之前已测定了供试菌株的蛋白水解能力（图1b），191 株乳酸乳球菌ΔFAN 范围为0.28～22.47 mmol/L[20]。依据ΔFAN 不同将全部菌株分为3 组做后续分析，分别为低蛋白水解菌株73 株（L组，ΔFAN＜3 mmol/L）、中蛋白水解菌株62 株（M组，3 mmol/L≤ΔFAN≤7 mmol/L），高蛋白水解菌株56 株（H 组，ΔFAN＞7 mmol/L），3 组之间也存在极显著差异（P＜0.01）。

图1 乳酸乳球菌的产酸速率以及FAN 的变化量Fig.1 The acid producing rate and FAN value of Lactococcus lactis

2.2 不同产酸速率菌株制备发酵乳滋气味品质的差异性分析

采用主成分分析法（PCA）对不同产酸速率的乳酸乳球菌制备发酵乳的滋气味进行分析，结果如图2所示。电子鼻和电子舌的结果均显示出S组发酵乳与M 组以及F 组有轻微的重叠，然而整体上呈分离趋势，这表明慢速产酸菌株所制备发酵乳的滋气味与快速和中速产酸菌株存在一定差异。表2为电子鼻的主成分特征向量值，PC1 中甲烷、乙醇以及有机硫化物具有最高的正系数，芳香成分具有极高的负系数，PC2 中氮氧化合物和硫化物的特征向量值较高。结合图2a 可知，位于右半图的S 组发酵乳，即慢速产酸菌株制备的发酵乳中，甲烷、乙醇以及有机硫化物响应值较高，而芳香成分响应值较低。

表2 电子鼻主成分特征向量值Table 2 Eigenvector value of principal component of electronic nose

图2 不同产酸速率乳酸乳球菌制备酸乳的滋气味品质PC1 与PC2 因子得分图Fig.2 Graphical representation of the principal component analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different acidogenic rate Lactococcus lactis

同样的，电子舌的主成分特征向量值（表3）显示，PC1 中酸味具有最大的正系数，而鲜味具有最大的负系数，PC2 中涩味的回味和鲜味的回味特征向量值分别为0.66 和0.46。结合图2b 可知，位于左侧的S 组发酵乳具有强烈的鲜味以及较弱的酸味。

表3 电子舌主成分特征向量值Table 3 Eigenvector value of principal component of electronic tongue

使用Mann-Whiney 分析确定与发酵乳滋味品质差异显著相关的指标（图3和图5）。由图3可知，3 组不同产酸速率菌株制备的发酵乳在氢气和烷烃以及涩味的回味上没有显著差异。在芳香成分上，S 组显著低于M 组和F 组，而在甲烷、乙醇以及有机硫化物上却显著高于M 组和F 组（P＜0.001）。在滋味方面，S 组发酵乳在酸味和涩味方面显著低于M 组和F 组，而在鲜味、鲜味的回味、咸味方面显著高于其余2 组（P＜0.001）。因此可知，中等和快速产酸菌株所制备的发酵乳与慢速产酸菌株相比芳香成分含量更高，并且具备较强的酸味和较弱的鲜味。

图3 不同产酸速率乳酸乳球菌制备发酵乳滋气味品质的差异性分析Fig.3 Difference analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different acidogenic rate Lactococcus lactis

2.3 不同蛋白水解能力菌株制备发酵乳滋气味品质的差异性分析

按照2.2 节中的方法对具有不同蛋白水解程度的乳酸乳球所制备发酵乳的气味和滋味进行分析。结果表明，高蛋白水解组（H 组）与其它2 组的滋气味存在一定的分离趋势（图4）。结合表2和表3可知，高蛋白水解组的菌株比其它2 组有较高的甲烷、乙醇以及有机硫化物和较低的芳香成分；在滋味方面，H 组具有较强烈的鲜味，而M 组和L 组酸味较强。

由图5可知，不同蛋白水解程度的3 组菌株制备的发酵乳在氢气、烷烃成分以及涩味的回味上没有显著差异。而芳香成分、乙醇指标的响应值3 组间均具有极显著差异（P＜0.001），这表明蛋白水解程度的差异对于芳香成分以及乙醇含量的影响较大。H 组的芳香成分显著低于其余2 组，而甲烷、乙醇、有机硫化物显著高于其余2 组（P＜0.001）。在滋味方面，H 组在咸味、鲜味和鲜味的回味上比其它2 组更为强烈，而在酸味和涩味方面弱于其它2 组。

图4 不同蛋白水解程度乳酸乳球菌制备酸乳的滋气味品质PC1 与PC2 因子得分图Fig.4 Graphical representation of the principal component analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different proteolysis level Lactococcus lactis

图5 不同蛋白水解程度乳酸乳球菌制备发酵乳滋气味品质的差异性分析Fig.5 Difference analysis of the taste and odor profile of milk fermented by different proteolysis level Lactococcus lactis

2.4 发酵乳滋气味品质与发酵特性的相关性分析

为探究发酵乳滋气味指标以及菌株产酸和蛋白水解程度之间的相关性，依据电子鼻和电子舌的响应值以及产酸速率、ΔFAN 值计算相关性指标，结果见图6。菌株的产酸速率与芳香类风味物质呈显著正相关，与甲烷类和乙醇呈显著负相关（图6a）。在滋味方面，菌株的产酸速率与酸味呈显著正相关，而与鲜味、鲜味的回味、咸味之间呈显著负相关（图6b）。菌株的产酸速率与蛋白水解程度呈显著负相关，因此蛋白水解程度与各滋气味的相关关系与产酸速率及各滋气味之间的关系正好相反。此外，各滋气味之间也存在相关性，例如：芳香成分与甲烷类和乙醇、酸味和鲜味存在显著负相关。

图6 相关性分析图Fig.6 Correlation analysis chart

3 讨论与结论

电子鼻和电子舌技术所产生的复杂数据集与多元统计分析相结合，非常有助于乳制品的滋味和气味指标的数字化评价，从而快速高效的分类、识别和鉴定样品[22]。O'riordan 等[23]研究发现基于电子鼻技术可以区分不同发酵剂在同一标准化方法下制造的干酪。白雪等[24]采用电子鼻检测后进行主成分分析可以很好的区分奶贝和酸奶中挥发性风味物质，且与GC-MS 分析后得到的结果一致。刘永吉等[25]研究表明电子舌结合PCA 分析以及判别因子分析（DFA）在区分岗稔酸乳品质方面效果良好，表明电子鼻与电子舌技术结合多元方差分析对于区分发酵乳制品品质具有较高的准确性。因此，本研究以191 株产酸和蛋白水解特性存在差异的乳酸乳球菌所制备的发酵乳为研究对象，通过电子鼻和电子舌技术，结合多元统计分析，探究不同发酵特性的乳酸乳球菌对发酵乳滋气味品质的影响。

本研究结果表明，中速和快速产酸菌株制备的发酵乳中芳香成分的响应值显著高于慢速产酸菌株所制备的发酵乳，而在甲烷、乙醇、有机硫化物等气味指标上显著低于慢速产酸组（P＜0.01）。中速以及快速产酸菌株产生的较强烈芳香类物质，可能是由于菌株快速代谢的糖类而产生的酸类、酮类以及蛋白质水解产生的一些胺类。丁海兵[26]研究表明，乳酸乳球菌在合成双乙酰时涉及到的酶类受pH 值的影响，当pH 值在5 左右时，乙酰乳酸脱羧酶的活性低于乙酰乳酸合成酶的活性时，发酵乳中的丁二酮才能得到有效积累。García-Cayuela 等[27]研究表明，乳酸乳球菌产生的芳香物质还涉及氨基酸的分解代谢，而pH 值变化会对相关酶的表达产生差异。倪春梅[28]在干酪成熟的研究中表明，发酵剂菌株代谢产生的乳酸使乳发生酸化，能够提高蛋白酶类活性，使得蛋白质进一步降解为小分子多肽。因此，快速产酸菌株能够使原料乳的pH 值快速降低，从而提高了某些酶类的活性进而产生了较高的芳香成分。电子舌结果表明，快速和速等产酸组的发酵乳酸味强于慢速产酸组，而鲜味较弱（P＜0.01）。这可能是由于产酸能力强的菌株快速分解乳糖产生乳酸，赋予了发酵乳明显的酸味；鲜味的主要来源为蛋白质分解所产生的一些氨基酸和简单的肽类[29]。慢速产酸菌株随着发酵时间的逐渐延长，底物消耗殆尽，菌株生长进入衰亡期。有研究表明，菌体死亡后释放的蛋白分解酶会逐渐分解蛋白质，产生一些碱性物质，如游离氨基酸和小肽等，从而导致一些呈鲜味氨基酸发挥作用[30]。

依据蛋白水解程度将菌株进行分组，并对其制备的发酵乳做滋气味的差异性分析，结果表明，高蛋白水解菌株所制备的发酵乳芳香成分响应值较低，而甲烷、乙醇、有机硫化物的响应值较高。值得注意的是，这一结果与产酸速率分组后得到的结果正好相反，进一步的Spearman 相关性分析结果表明，菌株的产酸速率与蛋白水解程度呈明显的负相关，与上述结果吻合。郦金龙等[31]认为不同微生物所能产生的酶系不同，导致对碳源的利用能力产生差异，从而影响菌株的产酸能力。关于菌株不同的蛋白水解能力，Neviani 等[32]研究表明，不同的嗜热链球菌显示了不同的氨基酸需求，一些氨基酸为基本需求，一些则为一般要求，而另一些则不需要。因此，菌株的蛋白水解能力与产酸能力的差异主要取决于菌株的自身特性。此外，Liu等[33]表明与乳酸乳球菌蛋白水解相关的蛋白酶、肽酶以及肽转运蛋白通常与菌株中特定质粒的存在相关，从而导致乳酸乳球菌蛋白水解能力存在差异。结合本研究结论初步认为，产酸速率慢的菌株对于碳水化合物的利用能力差，然而其对氨基酸的要求较高，或具有较高的蛋白酶类活性来供给菌株生长，在这个过程中产生了不同于快速产酸菌的风味物质从而影响了发酵乳的滋气味。

本研究采用电子鼻和电子舌技术，研究了191 株具有不同发酵特性的乳酸乳球菌所制备的发酵乳，在气味和滋味方面的差异和联系。结果表明，产酸较快而蛋白水解程度较低的菌株，能够使得发酵乳具有更多的芳香成分以及更强烈的酸味；产酸慢而具有较高蛋白水解能力的菌株，则使得发酵乳有更多的甲烷、乙醇、有机硫化物成分以及较强的鲜味。相关性分析验证后发现乳酸乳球菌的产酸能力与蛋白水解程度呈显著负相关（P＜0.01）。综上所述，本研究从发酵乳滋气味的角度出发，探究了不同发酵特性的乳酸乳球菌对发酵乳滋气味所做的贡献，为今后研究具体的差异风味物质奠定了基础，也为探究乳酸乳球菌发酵特性的差异与联系提供了新思路。