黄连解毒汤对变应性鼻炎大鼠TLR4/NF-κB信号通路及黏膜杯状细胞的影响*

刘书芹， 李桂华， 赵 娜， 刘新明， 张洁瑛， 王金贵

（天津中医药大学第一附属医院推拿科，天津300193）

变应性鼻炎属于过敏性鼻炎，是耳鼻喉科常见病和多发病，临床上表现为打喷嚏、鼻塞和鼻痒，分泌大量清水样鼻涕［1］。炎症因子、免疫细胞、炎症细胞等参与鼻部变态反应，而鼻部分泌的黏液可起润滑作用，实现对鼻黏膜上皮细胞的保护作用，但过量黏液则可损坏鼻黏膜分泌功能，恶化鼻黏膜生理防御功能［2］。目前该病在临床上以糖皮质激素、过敏反应介质阻断剂、免疫调节剂等治疗为主，这些药物虽可在一定程度上缓解疾病，但患者多出现不良反应［3］。而传统中药可减少不良反应、且效果良好。黄连解毒汤（Huanglian-jiedu decoction，HLJD）是清热解毒代表方，具有抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等作用，在肠道黏膜中可改善免疫功能从而缓解疾病［4］。Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）表达于免疫细胞表面，能特异性识别特定病原菌，且活化的TLR4 能激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 信号通路参与免疫和炎症反应［5］。我们推测黄连解毒汤可能通过TLR4/NF-κB 通路影响变应性鼻炎。因此，本研究通过卵白蛋白制备变应性鼻炎大鼠模型，探究黄连解毒汤对变应性鼻炎的影响及可能的作用机制，以期为治疗变应性鼻炎提供一定的参考。

材 料 和 方 法

1 动物

SD 大鼠购自北京维通利华有限公司［许可证号：SCXK（京）2019-0009］，SPF 清洁级，体重（200±20）g。所有大鼠在清洁、安静、通风良好的环境中饲养，自然光照，温度25℃，相对湿度50%，自由饮食、饮水，定期更换垫料、添加饲料及饮用水，定期清理、消毒鼠笼。本研究经本院伦理协会审核并通过。

2 主要试剂及仪器

黄连解毒汤的方剂由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成。根据本实验室已有提取黄连解毒汤制剂工艺，各成分分别取10 g，加10 倍水加热煮沸1.5 h，过滤得滤液Ⅰ；药渣部分加8倍水加热煮沸1 h，过滤得滤液Ⅱ；合并滤液Ⅰ和Ⅱ，煮沸蒸干浓缩至300 mL，经鉴定得率为26.73%。

丙酸氟替卡松鼻喷雾剂（葛兰素史克制药集团）；卵白蛋白（上海泽叶生物公司）；氢氧化铝（国药集团化学试剂有限公司）；高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）和苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（北京索莱宝有限公司）；大鼠白细胞介素（interluekin，IL）-4 和IL-5 ELISA 试剂盒，兔抗 TLR4、NF-κB p65 和 β-actin 抗体（Abcam）。RT-qPCR仪（ABI）；凝胶成像系统（上海天能公司）。

3 主要方法

3.1 动物造模及分组 参考文献［6］制备变应性鼻炎大鼠模型，实验前将0.3 mg 卵白蛋白和30 mg 氢氧化铝佐剂溶于1 mL 生理盐水中制成混悬液，腹腔注射大鼠致敏，隔天1 次，连续8 次，第16 天每只大鼠两侧鼻腔均给予5%卵白蛋白生理盐水溶液滴鼻（每侧50 μL），同时超声雾化吸收1%卵白蛋白5 min，每天1次，连续7 d，造模结束后行为学观察评分评价造模情况。将造模成功大鼠随机分为：模型组，HLJD低、中、高剂量组，以及阳性对照组，每组10只。对照组10 只大鼠给予等体积生理盐水相同操作。HLJD 低、中、高剂量组分别按生药 5、10 和 20 g/kg 的量灌胃，阳性对照组给予丙酸氟替卡松鼻喷雾剂（每侧鼻腔 50 μg）［7］，对照组和模型组灌胃和喷雾等体积生理盐水，每天1次，连续10 d。

3.2 行为学观察评分 末次造模结束后及治疗结束后参考文献［8］判定造模情况和治疗情况。喷嚏数：1～3个为1分，4～10个为2分，≥11个为3分；鼻痒程度：轻度瘙痒1～2次为1分，剧烈瘙痒、抓耳挠鼻为2 分；流鼻涕情况：鼻涕流至鼻孔为1 分，鼻涕超出鼻孔为2分，涕流满面为3分。每项叠加为行为学总评分，超过5分即为造模成功。

3.3 症状观察 滤纸条剪成1 mm×25 mm 细条状，治疗结束及行为学观察评分鉴定后将滤纸条插入大鼠一侧鼻腔中，吸取鼻腔分泌物，滤纸条放置5 min后减重法称量滤纸吸附鼻腔分泌物重量［9］。

3.4 PAS 染色观察黏膜杯状细胞情况 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，鼻背正中缝处裂开鼻腔，剖析出鼻黏膜组织，一侧置于-80℃冰箱保存，另一侧迅速置于4%多聚甲醛中固定8 h，石蜡切片，部分PAS染色后，400倍下观察杯状细胞情况。杯状细胞相对比例（%）=计数杯状细胞个数/上皮细胞个数×100%。

3.5 HE 染色观察鼻黏膜组织形态学的变化 石蜡切片，经HE染色试剂盒染色后，200倍显微镜下观察嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞情况，观察炎症和小血管的情况。

3.6 ELISA 法检测鼻黏膜组织中IL-4 和IL-5 的水平 -80℃冰箱中取部分组织，匀浆后取上清，采用大鼠IL-4和IL-5 ELISA试剂盒检测鼻黏膜组织中IL-4和IL-5水平。

3.7 RT-qPCR 检测黏膜组织中鼠钙激活氯通道3（mouse calcium-activated chloride channel 3，mCLCA3）和黏蛋白 5AC（mucin 5AC，MUC5AC）的 mRNA 水平 -80℃冰箱中取部分组织，Trizol法提取总RNA，cDNA 反转录试剂盒逆转录为cDNA 后进行扩增。mCLCA3 的 上 游 引 物 序 列 为 5′-GGAGGAGTCACTTCAGACAGA-3′，下游引物序列为5′-CACCTGCATTTCCCCTAGCC-3′；MUC5AC 的上游引物序列为 5′-GGGCAGCGCTACAGTTTCAG-3′，下游引物序列 为 5′-TCAGTGACAACACGAAAGGC-3′；GAPDH的上游引物序列为5′-ACCACAGTCCATGCCATAC-3′，下游引物序列为 5′-TCCACCACCCTGTTGCTG-3′。反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 50 s、60℃ 65 s，40个循环。2-ΔΔCt法计算mRNA相对水平。

3.8 Western blot 实验检测黏膜组织中TLR4 和NF-κB p65 的蛋白水平 剩余黏膜组织冰上匀浆裂解，4℃、10 000×g离心20 min 的上清液即为总蛋白。取等质量总蛋白电泳，转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，分别加入兔源抗TLR4、NF-κB p65 和β-actin抗体，4℃孵育过夜；加入羊抗兔Ⅱ抗，室温孵育1 h，增强化学发光法显色，凝胶成像系统拍照，Quantity One 软件分析各组蛋白灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值。

4 统计学处理

所有数据采用SPSS 24.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 黄连解毒汤对大鼠行为学评分和鼻腔分泌物量的影响

治疗结束后，与对照组相比，模型组的行为学评分及鼻腔分泌物量均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄连解毒汤低、中、高剂量组和阳性对照组的行为学评分及鼻腔分泌物量均显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 大鼠行为学评分、鼻腔分泌物量和黏膜组织中杯状细胞相对比例的比较Table 1.Comparison of the behavioral scores，nasal secretion and relative proportion of goblet cells in the mucosa of the rats in the 6 groups（Mean±SD. n=10）

2 黄连解毒汤对鼻黏膜组织杯状细胞的影响

杯状细胞底部狭窄，顶部膨大，PAS染色为紫红色。与对照组相比，模型组黏膜组织中杯状细胞相对比例显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄连解毒汤低、中和高剂量组及阳性对照组黏膜组织中杯状 细胞相对比例显著降低（P＜0.05），见图1及表1。

Figure 1.PAS stainning of the nasal mucosa（×400）.图1 鼻黏膜组织的PAS染色情况

3 黄连解毒汤对鼻黏膜组织形态学影响

对照组鼻黏膜组织排列均匀，形态正常；模型组鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞浸润严重，炎症浸润明显，出现明显的小血管扩张和间质水肿现象；随着黄连解毒汤剂量的升高，淋巴浸润现象明显减少，但嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润仍然存在，炎症浸润缓解；阳性对照组出现少量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞浸润，见图2。

Figure 2.The morphological changes of the nasal mucosa observed by HE staining（×200）.图2 鼻黏膜组织的HE染色情况

4 黄连解毒汤对鼻黏膜组织中IL-4 和IL-5 水平的影响

与对照组相比，模型组黏膜组织中的IL-4 和IL-5 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄连解毒汤低、中、高剂量组和阳性对照组黏膜组织中的IL-4和IL-5水平显著降低（P＜0.05），见表2。

5 黄连解毒汤对黏膜组织中mCLCA3 和MUC5AC mRNA水平的影响

与对照组相比，模型组黏膜组织中mCLCA3 和MUC5AC 的mRNA 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄连解毒汤低、中、高剂量组和阳性对照组黏膜组织中mCLCA3 和MUC5AC 的mRNA 水平显著降低（P＜0.05），见表2。

6 黄连解毒汤对鼻黏膜组织中TLR4和NF-κB p65蛋白水平的影响

与对照组相比，模型组黏膜组织中TLR4 和NF-κB p65蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄连解毒汤低剂量组黏膜组织中TLR4蛋白水平，黄连解毒汤中、高剂量组和阳性对照组黏膜组织中TLR4 和NF-κB p65 蛋白水平均显著降低（P＜0.05），见图3及表2。

讨 论

TLR4 广泛存在于黏膜巨噬细胞、树状突细胞、黏膜上皮细胞和杯状细胞中，是第一个人类发现的TLR 相关蛋白［10］，作为细胞膜上受体，在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用，过度激活TLR 会持续产生促炎因子和趋化因子，破坏免疫稳态，从而导致疾病发生［11］。刺激 TLR4 可促进 NF-κB 的释放 ，NF-κB 作为TLR 中枢枢纽，广泛存在于免疫细胞中，参与炎症、淋巴细胞成熟、获得性免疫等多种过程［12-13］。本研究发现，与对照组相比，模型组鼻黏膜组织中TLR4、NF-κB p65 蛋白水平升高，提示在变应性鼻炎中TLR4 处于激活状态，激活TLR4 可促进NF-κB 的释放从而参与机体炎症、免疫过程。在变应性鼻炎中，炎症现象明显，免疫出现失衡，导致TLR4 过度激活导致炎症因子IL-4 和IL-5 水平升高从而加重疾病［14］，提示在变应性鼻炎中IL-4 和IL-5处于高水平状态，炎症反应严重。

表2 大鼠鼻黏膜组织中IL-4和IL-5水平、mCLCA3和MUC5AC mRNA水平及TLR4和NF-κB p65蛋白水平的比较Table 2.Comparison of the IL-4 and IL-5 levels，the mRNA levels of mCLCA3 and MUC5AC，and the protein levels of TLR4 and NF-κB p65 in the rat nasal mucosa of the 6 groups（Mean±SD. n=10）

Figure 3.The representative images of Western blot for determining the protein levels of TLR4 and NF-κB p65 in the rat nasal mucosal tissues of the 6 groups.图3 Western blot检测6组大鼠鼻黏膜组织中TLR4和NF-κB p65蛋白水平的变化

杯状细胞增生是黏液高分泌的主要病理特征，是变应性鼻炎的特征［15］。黏蛋白是黏液的主要成分，决定黏液弹性和黏性，其中病理状态下MUC5AC占优势，且由杯状细胞分泌，被认为是杯状细胞化生的标志［16］。近年来，离子通道与黏液高分泌备受关注，钙激活氯通道是其中之一，mCLCA3 和hCLCA1是同源CLCA 通道，在电解质转运、黏液分泌方面发挥重要作用［17］。本研究发现，与对照组相比，模型组鼻黏膜组织中杯状细胞相对比例、mCLCA3 和MUC5AC mRNA 水平升高，提示变应性鼻炎时，黏膜杯状细胞数量增加，从而促进杯状细胞增生相关基因表达，诱发变应性鼻炎气道黏液过度分泌，加重疾病进程。而黄连解毒汤在现代药理研究中应用广泛，不仅具有消炎抗菌作用，还具有降压、止血、改善慢性脑缺血等多种作用［15］，但尚未发现其对变应性鼻炎的作用研究。研究表明，雷公藤内酯醇可能通过抑制NF-κB 进而抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生和MUC5AC 表达［13］。本研究发现，与模型组相比，黄连解毒汤低、中、高剂量组的行为学评分、鼻腔分泌量降低，黏膜组织中的 IL-4 和 IL-5 水平、mCLCA3 和MUC5AC 的 mRNA 水平及 TLR4 蛋白水平降低，提示黄连解毒汤可能是通过抑制TLR4/NF-κB 通路来抑制mCLCA3 和MUC5AC 表达，从而减少炎症因子释放、减少杯状细胞相对比例及其分泌的黏液量，最终减少打喷嚏次数、缓解鼻痒、减少鼻涕分泌量，缓解黏液损坏鼻黏膜分泌功能从而缓解疾病。

综上所述，本文验证了黄连解毒汤可缓解变应性鼻炎，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB 信号通路，减少杯状细胞相对比例有关。