miR-30b在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用*

周 薇， 徐金升， 白亚玲， 张慧然， 何 雷， 张胜雷， 张东雪

（河北医科大学第四医院肾内科，河北石家庄050011）

血管钙化（vascular calcification，VC）与心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）和慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者的死亡率有关［1-2］，且在 CKD 患者全因死亡率中 CVD 死亡率占第1 位［3-4］。VC 是一个复杂的过程，涉及不同的分子途径，包括血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）转化为成骨细胞样细胞［5］。VSMCs 暴露于高磷（high phosphcrus，HP）和（或）高钙环境下会导致钙化增加，与成骨信号通路有关［6］，而成骨信号通路和VC 的主要特征是Runt 相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）的特异性上 调［7］。 miR-30s、miR-204 等 miRNAs 通 过 参 与VSMCs 向成骨样细胞的转分化，进而参与血管钙化［8］。miR-30b 在肿瘤细胞转移及凋亡中起着重要作用［9-10］。为进一步研究 HP 条件下 miR-30b 通过何种途径影响大鼠VSMCs 钙化，本研究以体外培养的大鼠VSMCs 为研究对象，探讨miR-30b 在HP 诱导的大鼠VSMCs钙化发生过程中的作用及其可能机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

DMEM 培养液及胎牛血清均购自Gibco；β-甘油磷酸购自Sigma；茜素红染料购自Solarbio；钙含量测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司；碱性磷酸酶（abkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒购自南京建成生物公司；RNA 提取试剂盒及RNA反转录试剂盒均购自Thermo Fisher；实时荧光定量PCR 试剂盒购自广州易锦生物技术有限公司；PCR引物、miR-30b 模拟物（miR-30b mimic，mimic-30b）及其阴性对照（mimic-NC）均购自广州市锐博生物科技有限公司；抗Runx2 抗体购自Abcam；抗GAPDH抗体购自Bioworld。

2 模型的制备与分组

2.1 体内实验 5/6 肾切除术加骨化三醇灌胃法构建钙化模型［11］。取4周龄、体重80～100 g的清洁级雄性健康SD 大鼠（由河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号为1305090），随机分为假手术（sham）组和慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）所致VC（CRF+VC）组。假手术组大鼠未行肾切除，仅将肾周筋膜分离，且术后给予1.5%甲基纤维素灌胃；CRF+VC 组行5/6 肾切除术，且术后给予1.5%甲基纤维素加上骨化三醇（600 ng·kg-1·d-1）灌胃，共20 d。

2.2 体外实验 分离大鼠胸主动脉，用组织贴壁法行 VSMCs 原代培养［11］。取第 3～4 代细胞接种于 6 孔板中，融合度至70%～80%时给予刺激。将VSMCs分为正常（normal，N）组和HP（10 mmol/L β-甘油磷酸）组。为进一步验证miR-30b 对VSMCs 的作用，将细胞分为3组：HP组（细胞未转染）、mimic-NC 组（转染mimic-NC）和mimic-30b 组（转染mimic-30b），均给予10 mmol/L β-甘油磷酸。

3 方法

3.1 血管钙化染色 玻片滴加5%硝酸银溶液，紫外光照射1 h，于碱性品红溶液中复染，显微镜下观察血管的钙化情况，钙盐沉积处呈黑色。

3.2 血管钙含量测定 将烤干的大鼠胸主动脉10 mg，放入盐酸（0.6 mmol/L）中37℃过夜，取上清液测钙含量，酶标仪600 nm 处检测吸光度，计算出钙含量，以mg/g为单位。

3.3 免疫组织化学法检测血管Runx2 的表达 使用罗氏全自动免疫组化染色仪，进行染色，选择中修复，Ⅰ抗孵育30 min，棕黄色颗粒为阳性。随机选取6 个高倍视野，阳性细胞和染色强度积分相加大于3分为阳性。

3.4 细胞茜素红染色 取第3 代VSMCs 接种于12孔板，当细胞融合度至70%～80%时进行干预，用95%乙醇于室温固定30 min，用0.1%茜素红染液（pH 8.4）染色，于37℃孵育30 min，观察钙结节染色情况（橘红色结节为钙盐沉积）并照相。

3.5 细胞钙含量测定 将VSMCs 接种于12 孔板，细胞刺激后弃上清液，用1 mol/L稀盐酸脱钙24 h，取上清液，测定钙含量。VSMCs 用0.1 mol/L 氢氧化钠和0.1%十二烷基硫酸钠溶解30 min，测定蛋白质含量。细胞钙含量用钙与蛋白质含量的比值表示［mg/（g protein）］。实验均重复3次。

3.6 细胞ALP 活性测定 将VSMCs 接种于12 孔板，细胞刺激后弃上清液，加100 μL 1% TritonX-100，4℃冰箱静置30 min，充分裂解细胞，离心取上清液，酶标仪选取520 nm波长测定吸光度；测定蛋白质含量来校正ALP 的活性，单位为U/（g protein）。实验均重复3次。

3.7 RT-qPCR 实验 提取刺激后VSMCs 的RNA，测定miR-30b及Runx2 mRNA的表达。检测miR-30b时以5S rRNA 为内参照，反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。检测 Runx2 mRNA 时以 GAPDH 为内参照，反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性20 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸20 s。Runx2 的上游引物序列为5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3′，下游引物序列为 5′-CGCTCCGGCCCACAAATCTC-3′；GAPDH 的上游引物序列为5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物序列为 5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。记录数据，实验均重复3次。

3.8 Western blot 检测Runx2 蛋白表达 提取刺激后 VSMCs 的总蛋白，取 50 μg 进行 10% SDS-PAGE（恒压95 V 持续1.5 h），再以恒压95 V 转膜1 h，牛奶封闭 1 h，加入I 抗（抗GAPDH 抗体1∶5 000 稀释，抗Runx2 抗体1∶500 稀释），4℃孵育过夜；洗膜，加入II抗（1∶5 000），室温下孵育1 h，于蛋白成像仪上显色。实验均重复3次。

4 统计学处理

应用SPSS 22.0 软件进行统计学处理。正态分布的计量资料结果用均数±标准差（Mean±SD）表示。两组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析；相关性评估采用Pearson 相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠血管组织钙化及Runx2表达情况

硝酸银染色结果显示CRF+VC 组黑色沉积比sham 组显著增多，而免疫组化染色显示CRF+VC 组Runx2褐色沉积显著增多，见图1A；组织钙含量结果显示，CRF+VC 组钙含量显著增加（P＜0.05），见图1B；相关分析结果显示，Runx2与血管钙化呈显著正相关（r=0.971，P＜0.05），见图1C。

Figure 1.Vascular calcification and Runx2 expression.A：silver nitrate staining（black）and Runx2 immunohistochemical staining（brown），scale bar=20 μm；B：tissue calcium content determination；C：Runx2 and calcium content correlation analysis.Mean±SD. n=6.**P＜0.05 vs sham group.图1 血管组织钙化及Runx2表达情况

2 HP对大鼠VSMCs钙化的影响

2.1 VSMCs 茜素红染色及钙含量测定 茜素红染色显示，与N 组比较，HP 组茜素红染色橘红色钙节明显增多，见图2A；钙含量测定结果显示，HP 组VSMCs钙含量显著升高（P＜0.05），见图2B。

2.2 HP 对大鼠 VSMCs 中 Runx2 表达和 ALP 活性的影响 RT-qPCR 和 Western blot 结果显示，与 N 组比较，HP组大鼠VSMCs中Runx2的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），见图3A、B；ALP 活性测定结果显示，HP 组大鼠 VSMCs 中 ALP 活性较 N 组显著增强（P＜0.05），见图3C。

2.3 HP对大鼠VSMCs中miR-30b表达的影响 RT-qPCR 结果显示，与 N 组比较，HP 组大鼠 VSMCs 中miR-30b的表达显著降低（P＜0.05），见图4。

3 miR-30b对HP诱导的大鼠VSMCs钙化的影响

3.1 转染mimic-30b 后miR-30b 的表达情况 RT-qPCR 结 果 显 示 ，与 HP 组 和 mimic-NC 组 比 较 ，mimic-30b 组大鼠 VSMCs 中 miR-30b 的表达水平显著升高（P＜0.05），见图5。

Figure 2.Calcification of the vascular smooth muscle cells in the 2 groups.A：alizarin red staining of VSMCs after high phosphorus（HP）induction（scale bar=200μm）；B：calcium content determination.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal（N）group.图2 两组血管平滑肌细胞钙化情况

Figure 3.The mRNA（A）and protein（B）expression of Runx2，and ALP activity（C）in the vascular smooth muscle cells of the 2 groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs N group.图3 两组血管平滑肌细胞Runx2表达和ALP活性测定

Figure 4.Expression of miR-30b in vascular smooth muscle cells of the 2 groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs N group.图4 两组血管平滑肌细胞的miR-30b的表达

Figure 5.Expression of miR-30b in the vascular smooth muscle cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs HP group；#P＜0.05 vs mimic-NC group.图5 各组血管平滑肌细胞miR-30b的表达

3.2 miR-30b 对大鼠VSMCs 茜素红染色及钙含量的影响 茜素红染色显示，与HP 组和mimic-NC 组比较，mimic-30b 组橘红色钙结节显著减少，见图6A；钙含量测定结果显示，mimic-30b组钙含量较HP组和mimic-NC组显著降低（P＜0.05），见图6B。

Figure 6.Effect of miR-30b on calcification of vascular smooth muscle cells.A：alizarin red staining of VSMCs after transfection with mimic-30b（scale bar=200 μm）；B：calcium content determination.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs HP group；#P＜0.05 vs mimic-NC group.图6 miR-30b对血管平滑肌细胞钙化的影响

3.3 miR-30b对大鼠VSMCs中Runx2表达和ALP活性的影响 RT-qPCR和Western blot结果显示，与HP组和 mimic-NC 组比较，mimic-30b 组大鼠 VSMCs 中Runx2 的mRNA 和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图7A、B；ALP 活性测定结果显示，与HP组和mimic-NC组比较，mimic-30b组ALP活性显著降低（P＜0.05），见图7C。

Figure 7.The mRNA（A）and protein（B）expression of Runx2，and ALP activity（C）in the vascular smooth muscle cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs HP group；#P＜0.05 vs mimic-NC group.图7 各组血管平滑肌细胞Runx2表达和ALP活性测定

讨 论

高磷血症是导致血管中膜钙化的重要危险因素［12］，VSMCs 是血管中膜的重要组成成分。研究表明，VSMCs 的表型转化是导致VSMCs 钙化发生的重要机制之一［5］。本研究采用体外培养的大鼠原代VSMCs，探究HP 诱导的大鼠VSMCs 钙化的发生机制。结果显示HP可诱导大鼠VSMCs钙化，可能是通过抑制miR-30b 表达、促进大鼠VSMCs 表型转化实现的。

Runx2是血管平滑肌细胞发生表型转化的标志，而ALP 是血管钙化发生的经典生物标志物［5］。在成骨/软骨细胞样表型的VSMCs 中，成骨转录因子Runx2 和矿化调节蛋白 ALP 表达上调［13］。本研究构建大鼠钙化模型，发生钙化的大鼠血管组织Runx2表达升高，且Runx2 表达与血管钙化显著相关。为了进一步验证HP 在血管钙化中的作用，给予HP 刺激，验证了HP 可以促进大鼠VSMCs 的表型转化，进而引起细胞钙化。

研究显示miR-30s、miR-204、miR-141等miRNAs参与血管平滑肌细胞的表型转化和血管重塑，同时在成骨细胞和破骨细胞分化过程中也有miRNAs 参与，这意味着miRNAs 参与了VSMCs 介导的血管钙化［14-15］。Balderman 等［16］报道了在骨形态发生蛋白 2诱导人动脉平滑肌细胞VC 过程中miR-30b 的表达降低，并且miR 微阵列和靶预测数据库分析表明miR-30b 可以调控Runx2 表达。本研究显示给予HP刺激大鼠VSMCs 后，miR-30b 的表达下降，由此可见，HP 抑制miR-30b 的表达。为进一步验证HP 条件下miR-30b 对大鼠VSMCs 的影响，在HP 诱导条件下给予细胞过表达miR-30b，以探讨miR-30b 对于HP诱导的VSMCs钙化的缓解作用。结果显示，转染miR-30b 的类似物后钙化减少，且Runx2 表达和ALP活性降低。进一步说明了HP 条件下，过表达miR-30b 可抑制 Runx2 表达，对 HP 诱导的大鼠 VSMCs 钙化起到缓解作用。

综上所述，HP可以通过抑制miR-30b表达，促进Runx2表达，进而促进大鼠VSMCs钙化的发生。