HSV-1糖蛋白B和糖蛋白D的T细胞表位重组核酸疫苗的构建及其免疫原性

（中国医科大学附属第一医院眼科，沈阳 110001）

单纯疱疹病毒性角膜炎是由Ⅰ型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）感染引起的角膜疾病。HSV-1感染角膜后，病毒入侵角膜细胞，在角膜细胞内复制、增殖，引起细胞病变，导致细胞水肿、破裂。单纯疱疹病毒性角膜炎急性发作期的典型临床表现为疱疹、树枝状或者地图状角膜溃疡、角膜刺激症状。初次感染病毒后，机体免疫力强时可清除病毒，但如果机体免疫力无法清除病毒，病毒经感觉神经末梢侵入三叉神经节，进入三叉神经节后病毒不再复制增殖，在三叉神经节中潜伏即进入潜伏期，HSV-1的特点为终身潜伏［1］。机体免疫功能降低时，潜伏感染的 HSV-1重新活化，引起单纯疱疹病毒性角膜炎复发，单纯疱疹病毒性角膜炎反复发作会使角膜的透明度改变，造成视力严重损害，甚至致盲。因此，单纯疱疹病毒性角膜炎发病是病毒和免疫双重作用的结果。单纯疱疹病毒性角膜炎降低患者的视觉质量，严重影响患者的生活，而且给家庭和社会造成巨大的负担。目前，单纯疱疹病毒性角膜炎尚无特效防治方法。因此，研制一种可以防止感染HSV-1的疫苗具有远大前景。

新型核酸疫苗诱导机体产生免疫应答的过程和病毒自然感染过程相似，但缺乏完整病毒结构，降低了传统减毒或者灭活疫苗病毒感染的风险，同时更稳定，易于改造和构建［2］。本研究通过联合应用生物信息学预测软件，预测出HSV-1糖蛋白B（glycoprotein B，gB）和糖蛋D（glycoprotein D，gD）的潜在T细胞表位，结合数据库中已知表位，成功构建了HSV-1的T细胞多表位核酸疫苗，为今后的HSV-1核酸疫苗进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

293T细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司；真核表达质粒pVAX、HA-Tag购自上海吉凯基因科技有限公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；PBS购自中国双螺旋公司；胰酶购自中国碧云天公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；TureColor双色预染蛋白Marker购自中国上海生工生物有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；C57BL/6小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司；壳聚糖购自美仑生物技术有限公司；γ干扰素（interferon γ，IFN-γ）ELISA试剂盒购自联科生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HSV-1 T细胞表位重组串联抗原疫苗的设计：登录美国国家生物技术信息中心网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）获得HSV-1（17株）gB和gD的氨基酸序列。登录免疫表位数据库（Immune Epitope Database，IEDB，http：//www.iedb.org）查阅已发表的表位，结合相关文献，筛选出gB和gD的无症状表位。T细胞表位的预测采用生物信息学软件Syfpeithi（http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）和IEDB［3］。将各表位按照在基因组上的序列进行串联，为了保证各表位的独立性，更好地发挥免疫效应，避免连接区产生新的表位，表位间加入甘氨酸丝氨酸（glycine serine，GS）做为间隔序列。同时，在序列起始部加入免疫球蛋白IgE引导序列MDWTWILFLVAAATRVHS，增加DNA疫苗的表达。末端加入HA-Tag标签进行标记，两端加入NheⅠ/XhoⅠ酶切位点［4］。利用DNAMAN，将设计的多表位氨基酸序列复原成核苷酸序列，同时优化密码子，设计合成多表位基因盒，将其命名为Tg。

1.2.2 重组真核表达质粒pVAX-Tg的构建：设计合成的多表位基因盒Tg由上海吉凯基因科技有限公司合成并定向克隆入质粒pVAX，重组的质粒命名为pVAX-Tg。

1.2.3 293T细胞的培养和转染：293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。选择生长良好的细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁、细胞生长至密度约为70%时，采用Lipofectamine 2000进行转染，转染方法参见转染试剂说明书。同时设置 pVAX空载体转染对照组，继续培养细胞48 h。

1.2.4 Western blotting检测体外转录和翻译：质粒转染293T细胞48 h后，提取细胞总蛋白进行Western blotting检测，用15%聚丙烯酰胺凝胶恒压80 V电泳2.5 h。先进行考马斯亮蓝染色，观察到清晰的条带，进行脱色。脱色结束后，将凝胶进行扫描或照相，转印至PVDF膜后封闭。孵育一抗，脱脂奶粉稀释一抗HA-Tag 抗体，稀释比例为1∶1 000，制成一抗工作液，倒入杂交袋中，放入PVDF膜，压膜机封口进行一抗孵育。一抗孵育结束后，取出PVDF膜浸入TBST液中，轻摇摇床5 min，重复上述步骤4次。继续孵育二抗，稀释二抗羊抗小鼠IgG-HRP，稀释比例为1∶5 000，制成二抗工作液，倒入杂交袋中，放入PVDF膜，压膜机封口，进行二抗孵育。二抗孵育结束后，从杂交袋中取出PVDF膜浸入TBST液中，摇动摇床5 min，重复此操作6次。底物化学发光ECL法显影，置于暗室中进行胶片曝光。

1.2.5 制备壳聚糖疫苗并免疫动物：壳聚糖溶解在的NaAc-HAc溶液中配制成壳聚糖溶液，将DNA质粒溶解在Na2SO4溶液中，将2种溶液预热到55 ℃，等体积混合涡旋30 s，制成壳聚糖疫苗。选取健康雌鼠C57BL/6小鼠12只，分为实验组和对照组，每组6只。2组小鼠在适宜生活环境下喂养1周后再建立模型。免疫情况：实验组小鼠肌肉多点注射pVAX-Tg，每只鼠100 μg/40 μL；对照组小鼠肌肉多点注射pVAX，每只鼠100 μg/40 μL。每隔2周免疫1次，共免疫3次，末次免疫1周后取血并分离血清。

1.2.6 ELISA试剂盒检测小鼠血清IFN-γ浓度：洗板并拍干后加样，复孔加入标准品，空白孔复孔加入标准品稀释液，样本孔加入血清样本，每孔加入检测抗体。封板膜封板震荡，室温孵育2 h。弃去液体洗涤，每孔加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。封板膜封板，振荡，室温孵育45 min洗板，每孔加显色底物TMB，避光室温孵育20 min。每孔加终止溶液，终止反应。测定并校准吸光度值，计算出相应的浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HSV-1 gB和gD抗原的T细胞表位

根据文献［5-7］，筛选出3条HSV-1 gB的无症状表位，2条HSV-1 gD的无症状表位。见表1。

利用生物信息学软件Syfpeithi和IEDB，预测出HSV-1 gB和gD抗原的T细胞表位，分别命名为T1～T8。见表2。

表1 HSV-1 gB和gD的无症状表位Tab.1 Asymptomatic epitopes of HSV-1 gB and gD

表2 筛选的HSV-1 gB和gD的预测表位Tab.2 Predicted epitopes within HSV-1 gB and gD

将各表位按照其在基因组上的顺序进行串联，表位间加间隔序列GS和内源性蛋白水解酶位点RGRKRRS，并加入免疫球蛋白IgE引导序列和HATag标签。根据设计的多表位氨基酸序列复原成核苷酸序列，并命名为Tg，序列如下：ATGGATTGGACTT GGATTTTATTTTTGGTTGCTGCCGCAACCCGTGTCC ATTCTTACCCTTATGATGTCCCAGACTATGCTTTCG TAGTGTGGGCGCTTCTCGGTCTAGGCTCCACAGTT GCTGCCGGACACGCAACGCTGGGGTCAAATTTATT GACTACCCCTAAATTTACAGGTTCGTATCTTGCGA ACGGCGGATTCCTCATCGGGAGTAGCTCTATAGA ATTTGCTCGCCTAGGTTCCCGAATGCTGGGCGACG TCATGGCCGTAGGATCAGCATTAGCGGTGGGGTT GCTTGTTCTCCGGGGTAGAAAGAGGCGTTCGGCTG TCATTCTATTCGTAGTGATCGTTGGCAGTATACTGT TTGTCGTAATTGTGGGATTAGGGAGCGCCTTGGTT GATGCATCTCTTAAAATGGGTTCCTCACTCCCCAT CACGGTCTACTATGCGGGCTCGAGTCTACCAATAA CTGTATACTATGCTGGAAGCACCGTGGCCGTTTAC TCTCTGAAGATTTAA。将设计合成的多表位基因盒Tg交付给上海吉凯基因科技有限公司合成并定向克隆入质粒pVAX，重组的质粒命名为pVAX-Tg。

2.2 重组质粒pVAX-Tg的真核细胞表达

SDS-PAGE凝胶电泳结果证实目的蛋白成功分离，SDS-PAGE凝胶电泳后进行Western blotting鉴定。结果显示，实验组pVAX-Tg出现了带HA-Tag标签的阳性识别条带，大小约18×103。而对照组pVAX未见带HA-Tag标签阳性识别条带，无目的蛋白的表达。见图1。

图1 pVAX-Tg的体外表达Fig.1 In vitro translation to detect pVAX-Tg expression

2.3 接种重组质粒pVAX-Tg后小鼠产生细胞免疫反应

IFN-γ是由T细胞产生的具有广泛抗病毒和免疫调节作用的细胞因子，本研究采用ELISA法检测小鼠血清IFN-γ浓度，监测细胞免疫的变化［8］。实验组小鼠接受重组质粒pVAX-Tg免疫，对照组小鼠接受空载体质粒pVAX免疫，实验组和对照组小鼠血清IFN-γ浓度分别为（270.815±61.347）pg/mL和（96.428±20.452）pg/mL，实验组明显高于对照组（P＜0.001）。

3 讨论

HSV-1为广泛存在于自然界的双链DNA病毒，由核衣壳和包膜组成。核衣壳参与病毒的复制，包膜促进HSV-1吸附宿主细胞。HSV-1包膜表面存在12种糖蛋白，分别为gB、gC、gD、gE、gG、gI、gH、gL、gJ、gM、gN和gK，糖蛋白在介导病毒入侵细胞和发挥免疫原性中起到重要作用。在这12种糖蛋白中，gB、gD的免疫原性最强，在介导病毒入侵和病毒潜伏中发挥重要作用，诱发机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫，而且gB、gD的蛋白质序列高度保守，不易突变［9］，因此本研究选取gB和gD的表位做为候选表位。虽然单一接种gB或gD核酸疫苗可以起到一定的免疫作用，但是免疫作用弱，保护作用不足以清除病毒感染，目前研究热点主要是gB、gD多表位核酸疫苗。

近年来，生物信息学广泛用于医学领域，在医学各个领域做出突出贡献。本研究通过生物信息学预测软件预测HSV-1的gB、gD潜在T细胞抗原表位，联合运用多种软件增加准确性，结合已发表文献中报道的明确具有保护作用的抗原表位，将预测表位和已知表位串联起来，设计合成HSV-1多表位核酸疫苗。为了增加DNA疫苗的免疫原性，在起始段加入IgE引导序列，该免疫佐剂安全有效，对眼表无副作用，同时易于操作。序列间加入GS间隔序列和内源性蛋白水解酶位点RGRKRRS，使各表位独立发挥免疫作用，避免形成新的表位［4］。利用DNAMAN对序列进行优化选择，将氨基酸序列复原成核苷酸序列，将核苷酸序列克隆入质粒pVAX，成功构建重组多表位核酸疫苗pVAX-Tg。该疫苗可在真核细胞中成功表达目的蛋白，与空载体相比，C57BL/6小鼠接种疫苗后血清IFN-γ显著升高，差异有统计学意义。IFN-γ具有很强的免疫调节作用，对清除病毒有重要意义，可作为观察疫苗是否有效的可靠指标［8］。

综上所述，本研究成功构建重组多表位核酸疫苗pVAX-Tg，并证实该疫苗能产生明显的免疫反应，为单纯疱疹病毒性角膜炎的防治提供了新的方向，具有一定意义。今后还需进一步探讨更多针对疫苗的研究策略。