恩格列净无定型的制备及性能*

赖姝彦，金辉，余春暖，梅光耀，汪海波，张朝霞，张国庆

(1.浙江理工大学药物晶体工程实验室，杭州 310018；2.浙江宏元药业有限公司，临海 317000)

固体药物结晶时，药物分子可以按照一种或多种排列方式进行排列，导致一种药物有一种或多种晶体形态，这种现象称为药物的多晶型现象[1]。同种药物不同晶型会表现出不同溶解度、溶解速率、生物利用度及吸收速率，许多药物的稳定晶型通常伴随着溶解度不高、溶出速率低及生物利用率差等劣势[2]，而无定型状态物质熵值大，处于热力学不稳定的状态，易转变为稳定的晶态物质[3]。因此，需要深入研究无定型态的稳定性、溶解度。恩格列净化学名称：(1S)-1，5-脱水 -1-C-[4-氯-3-[[4-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]苯基]甲基]苯基]-D-葡萄糖醇，相对分子质量为450.91[4]。恩格列净分子结构复杂，易形成不同的晶体结构，所以对于其多态性的研究十分必要[5]。由于恩格列净极难溶于水，因而提高其水中溶解度对体内溶出有重要意义[6]。一般来说，将药物化合物无定型化是提高其溶解度的手段之一[7-8]，按照文献[9]方法制备的恩格列净无定型是熔体凝固块体，基本无法进一步制成制剂。因此，探索简单有效技术制备粉体形态无定型恩格列净非常有必要。笔者在本研究通过旋蒸技术快速蒸发溶剂，得到粉体状无定型恩格列净，报道如下。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 恩格列净粗品由浙江宏元药业有限公司提供。无水乙醇、甲醇，含量均>99.5%，购于天津永达化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备 AG135型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.1 mg)；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州亚荣仪器有限公司)；ARL’XTRA 型粉末X射线衍射仪(瑞士 Thermo ARL公司)；Pyris 1型热重分析仪(美国PE公司)；Diamond型差示扫描量热仪(美国PE公司)；JFC 1600型离子溅射仪(日本JEOL公司)；JSM 5610LV型扫描电子显微镜(日本JEOL公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；Milli-Q超纯水仪(德国默克密理博公司)。

1.3A晶型及无定型的制备

1.3.1恩格列净A晶型的制备 以甲醇为溶剂，料液比恩格列净粗品：甲醇=1：(10～50)。溶液在60 ℃下溶清，且保温数小时溶液没有发生变化，再将混合溶液移至0 ℃冰浴中冷却析晶。经测试所得晶体为恩格列净A晶型[10]。

1.3.2恩格列净无定型的制备 粗品以料液比为1：10，在乙醇中溶清，转移至旋转蒸发仪，在水浴温度70 ℃以及真空度-0.1 MPa下至溶剂完全挥发，可获得恩格列净无定型。

1.4性能表征

1.4.1粉末X射线多晶衍射(powder X-ray diffraction，PXRD)表征 采用PXRD仪分析样品的晶态或非晶态。测试方法：将恩格列净样品置于样品架的凹槽中，用载玻片压制使其表面平整；再将装有恩格列净粉末的样品架固定在PXRD仪上进行测定。测试条件：阳极靶为Cu-Kα靶，设置管电压为40 kV，管电流为40 mA，在2°/min的扫描速度和0.02°的扫描步长下从3°扫描至40°，所采集的数据利用Jade软件进行分析。

1.4.2差示扫描量热 (differential scanning calorimetry，DSC) 表征 DSC仪可以分析判断样品结晶及熔融过程。测试方法：称取恩格列净样品3～8 mg，将样品置于铝坩埚中，盖上铝片压片。以氮气(N2)作为保护气氛，流速控制在20 mL·min-1，以10 ℃·min-1升温速率从40 ℃升至200 ℃。

1.4.3热重分析(thermo gravimetric analysis，TGA) 恩格列净无定型及A晶型的失重率采用热重分析仪测定。精密称取恩格列净样品3～8 mg，以10 ℃·min-1升温速率从25 ℃升温至600 ℃，N2为保护气氛，流速为20 mL·min-1。

1.4.4扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)表征 样品的表观形貌及尺寸可以利用扫描电子显微镜进行观察。扫描电镜的制样方法为：将导电胶带黏在样品台上，将样品均匀的铺在导电胶带上，再将样品台放入离子溅射仪进行镀金(10 mA，40 s)，样品镀金完成后置于扫描电子显微镜中进行观察，电子束斑尺寸为30 nm、加速电压设置为5 kV。

1.4.5高效液相色谱(HPLC)分析 利用高效液相色谱仪测定恩格列净无定型与A晶型在水中的表观溶解度。测试条件为：使用孔径为10 nm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，0.01%三氟乙酸溶液作为流动相A，乙腈为流动相B，线性梯度洗脱：0～10 min，检测波长225 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃。

标准曲线的制备：精确称取恩格列净无定型0.1，0.2，0.25，0.3，0.5 mg，恩格列净A晶型0.05，0.1，0.125，0.15，0.25 mg，置于10 mL超纯水中，进行超声直至样品完全溶于水中，所得的溶液为标准溶液，恩格列净无定型溶液浓度分别为0.01，0.02，0.025，0.03，0.05 mg·mL-1，恩格列净A晶型溶液浓度分别为0.01，0.0125，0.015，0.025，0.005 mg·mL-1，然后分别将溶液用孔径0.45 μm注射式过滤器滤过后，放入Agilent 1100型高效液相色谱仪进行HPLC测试，绘制标准浓度曲线。

1.4.6稳定性考察 将恩格列净无定型样品置于干燥器中10 周，室温25～35 ℃；相对湿度40%。每2周取样一次，采用PXRD及DSC表征其结构的变化及热力学变化。

2 结果

2.1恩格列净无定型与A晶型的晶体结构分析 X射线衍射图谱见图1所示。经Jade软件计算分析，A晶型的特征衍射峰分别为：13.240°、14.580°、18.757°、19.060°、20.18°和25.362°，与专利WO 2006/117359所述的A晶型结果一致。而无定型的PXRD图谱显示出很宽的弥散峰，这是典型的无定型特征衍射峰。

图1 恩格列净A晶型、无定型的X射线衍射图

2.2恩格列净无定型的热性能分析 不同晶型药物一般具有不同的熔点等热性能，图2a所示是恩格列净A晶型与无定型的DSC图谱，A晶型仅在152.0 ℃显示出一个强的吸热熔融峰。而无定型DSC曲线可以看出其有一个明显的放热峰和一个尖锐的吸热熔融峰，计算峰所在温度分别为120 和150.5 ℃，热焓值分别为-93.3和76.5 J·g-1。无定型样品约120 ℃放热峰是由于无序态向有序态转变时熵减小过程引起，表现为放热现象。熔融之前放热行为说明无定型恩格列净在约120 ℃发生转晶，为了进一步确定其转晶后的晶型，将转晶后样品进行X射线衍射测试，见图2b。由转晶恩格列净的PXRD图谱经Jade计算其特征衍射峰分别为：14.6°、18.8°、20.3°、25.1°，经对比这与A晶型的的特征峰基本一致。因此证明在120 ℃高温下，恩格列净无定型会发生转晶变为A晶型。进一步通过TGA测定无定型恩格列净是否含有溶剂，曲线见图3。在50～250 ℃内无明显失重现象，说明该无定型恩格列净无水合物存在，这表明它是无水无定型态。

图2 A晶型、无定型的DSC图谱(a)和恩格列净无定型重结晶的PXRD图谱(b)

2.3恩格列净无定型与A晶型的形貌分析 原料药的形貌，包括颗粒形态、尺寸对其性能和后续加工有较大的影响。通过SEM观察恩格列净无定型和A晶型的形貌，恩格列净无定型与A晶型的表观形貌见图4。可见，恩格列净的无定型态主要为片状结构，大小约50 μm；而A晶型表现为棒状和块体混合形态，颗粒较小。理论上讲，片状结构的比表面积比块体或棒状的比表面积大，比表面积对药物的溶解度有较大影响，一般比表面积越大，溶解性能越好。

图3 无定型恩格列净TGA图谱

图4 恩格列净扫描电镜图

2.4恩格列净无定型与A晶型的表观溶解度 固体药物化合物可能对其多态性具有不同的溶解度。对于恩格列净A晶型和无定型，通过HPLC以设定的间隔测量浓度，两种晶型都显示出类似的溶解过程。两个样品在测试过程中采用相同的进样量，与流动相混合进入色谱柱后多次吸附洗脱，最终绘制出色谱图，发现两者保留时间相同。如图5所示，恩格列净无定型与A晶型的保留时间一致，均在7.1 min，表明该无定型与A晶型同属于恩格列净化合物。

将标准溶液所测得峰面积及其对应的浓度进行线性回归计算，得到的恩格列净无定型表观溶解度的标准曲线的线性回归方程为：Y=43 239X(R2=0.999)；A晶型的标准曲线的线性回归方程为：Y=69 486X(R2=0.999)。

通过软件计算恩格列净两种晶型的色谱峰峰面积，发现无定型的峰面积明显大于A晶型，利用标准溶液测试所得数据绘制的标准曲线可以计算出二者的表观溶解度。从浓度曲线计算其饱和浓度，A晶型的水中饱和浓度为0.026 mg·mL-1，无定型水中的饱和浓度为0.054 mg·mL-1。无定型的表观溶解度比A晶型更好，这是由于无定型是长程无序的晶体结构，熵值大，其表面自由能小，在溶剂中易分散，因而有更高的溶解度。而A晶型是长程有序的晶体结构，处于热力学稳定状态，导致其溶解度小。

图5 恩格列净无定型与A晶型的高效液相色谱图

药物的溶解度在一定程度上影响生物利用度。因此，恩格列净无定型有潜力成为药物产品的活性药物成分(active pharmaceutical ingredient，API)。

2.5恩格列净无定型的稳定性分析 经过10 周的长期稳定性测试，所得PXRD和DSC数据见图6。结果表明在低温低湿条件下，无定型前2 周稳定性能良好。第4 周在14.682°，20.382°，23.482°出现A晶型恩格列净的特征衍射峰，即发生固固不可逆转的相变，部分无定型转晶为A晶型。

图6也显示该无定型样品在第4周出现熔融峰裂分，152 ℃处有弱的A晶型熔融峰。这表明该无定型样品中已经有小部分转晶为A晶型。结果说明，在低温低湿的储存条件下，无定型恩格列净具有一定的晶型稳定性。一般具备长期晶型稳定性的API有前景成为药用产品。

3 讨论

在本研究中，发现一种简单且有效的无定型恩格列净制备的新方法，即利用旋蒸技术快速将溶剂蒸发得到无定型恩格列净。PXRD测试结果确定该技术制得的产品为纯的无定形态恩格列净。从DSC分析可以看出，恩格列净无定型在约120 ℃发生转晶变为A晶型。利用高效液相色谱测试A晶型与无定型的溶解度，发现无定型化后恩格列净在水中的溶解度提高到0.054 mg·mL-1，较A晶型高出近2倍。

图6 恩格列净无定型10周的稳定性X射线衍射图谱(a)和DSC图谱(b)

无定型热稳定性测试表明：在低温和低湿度条件下，无定型恩格列净经过10 周的稳定性测试，前2 周没有发生转晶现象，说明其在低温低湿的条件下有一定的稳定型。因此，无定型有潜力成为药物产品的活性药物成分。