葛根素改善动脉粥样硬化大鼠血脂异常及炎症反应的作用机制*

胡彦武，杨温欣，包小雪，于帅，武子敬，李瑞丽

(1.通化师范学院医药学院，通化 134002；2.长春中医药大学研究生院，长春 130117)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种以动脉血管壁炎症改变为主的慢性进行性疾病，炎症反应出现在AS形成的各个阶段[1]。该病的发病机制尚未完全清楚，有学者认为血脂代谢异常可引发炎症反应，进而刺激内皮细胞分泌炎性因子，诱导单核细胞黏附、迁移至动脉管壁内膜形成AS斑块[2]。因此，控制炎症反应已成为治疗AS的新思路。

葛根素是从中药葛根中提取一种异黄酮类化合物，化学名为4，7-二羟基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基异黄酮，分子式为C21H20O9，相对分子质量416.37。近年来，对葛根素的研究一直都比较活跃，发现葛根素具有明显的心血管保护活性。研究显示，葛根素可显著降低ApoE-/-小鼠[3]、家兔AS模型粥样斑块炎症因子[4]的表达，并可通过调控NF-κB信号通路改善实验动物血脂异常、抑制AS时血管壁慢性炎症反应，但是否调控与NF-κB信号通路级联的丝裂原活化激酶(mitogen-activated kinase，MAPK)信号通路及深入机制，笔者尚未见报道。本研究旨在探讨葛根素对AS大鼠血脂代谢及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β等炎性因子水平的影响，并通过检测MAPK信号通路相关信号蛋白磷酸化情况，进而明确葛根素抗AS的作用及可能机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级Wistar雄性大鼠，体质量180～200 g，吉林大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)2007-0003。适应性喂养7 d，饲养温度(20±2)℃，相对湿度(50±10)%，实验前动物禁食12 h，自由饮水。

1.2药品与试剂 葛根素(四川维克奇生物技术有限公司，批号：181112，含量：98.0%)，辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司，批号：M018303)，胆固醇(百奥生物科技有限公司，批号：180621)，胆酸钠(美国Gibco公司，批号：8118241)，丙基硫氧嘧啶(上海朝晖药业有限公司，批号：180617)，维生素D3注射液(VD3，上海通用药业股份有限公司，批号：180905)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20180805，20180812，20180823，20180901)；TNF-α、IL-6、IL-1β 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒(上海远慕生物科技有限公司提供，批号分别为180712，180705，180714)，细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)1/2、p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun Nterminal kinase，JNK)、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为ZB-0426，ZB-0527，ZB-0621，ZB-0601，ZB-0514，ZB-0512)，BCA蛋白测定试剂盒(美国Thermo公司，批号：ZM02N0016)，电致化学发光(ECL)发光液和硝酸纤维素膜(美国Millipoer公司)。

1.3仪器与设备 倒置显微镜(日本Olympus公司)，URIT-660酶标仪(桂林优利特集团有限公司)，超低温冰箱(美国Thermo公司)，H1650台式低温离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，FA1004电子天平(上海精科天平仪器厂，感量：0.1 mg)。

1.4动物造模 采用高脂饲料诱导建立大鼠AS模型[5]。将60只大鼠按随机数字表法分为2组，分别为正常对照组15只和AS模型组45只。两组大鼠均自由饮水，正常对照组大鼠给予普通饲料，模型组大鼠给予高脂饲料(基础饲料80.8%+猪油10%+白糖5%+胆固醇3.5%+胆酸钠0.5%+丙基硫氧嘧啶0.2%)，并于造模开始时，模型组各鼠腹腔注射VD370 U·kg-1，每天1次，连续3 d。造模9周后，从两组大鼠中各随机选出5只，禁食(不禁水)12 h后，10%水合氯醛0.35 mL·(100 g)-1麻醉，腹主动脉取血后，剪取胸主动脉，进行TG、TC、LDL-C、HDL-C等血脂成分检测及病理学检查，以判断造模是否成功。

1.5动物分组及给药 AS模型复制成功后，将模型组剩余40只大鼠按随机数字表法分为4组，即模型对照组、辛伐他汀组(4 mg·kg-1·d-1)、葛根素大剂量组(60 mg·kg-1·d-1)、葛根素小剂量组(30 mg·kg-1·d-1)[5]，每组10只。辛伐他汀组和葛根素大、小剂量组分别灌胃给药，模型对照组和正常对照组剩余10只大鼠灌胃等量0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续给药4周。

1.6标本取材与制备 各组大鼠用10%水合氯醛0.35 mL·(100 g)-1麻醉，腹主动脉取血，分离血清，-80 ℃冰箱保存，用于检测TG、TC、LDL-C、HDL-C及TNF-α、IL-6、IL-1β等指标；分离整根主动脉，剪取主动脉弓段血管组织，切取薄片厚度2～3 mm，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、制成切片厚度4 μm，用于苏木精-伊红(HE)染色，另一部主动脉组织剥离外部脂肪组织，液氮保存，用于检测ERK1/2、p38、JNK及其磷酸化蛋白表达情况。

1.7观测指标

1.7.1检测大鼠血脂水平 采用COD-PAP酶法测定各组大鼠血清TC水平，GPO-PAP酶法测定TG水平，采用直接法测定LDL-C、HDL-C水平。

1.7.2检测大鼠血清炎性因子水平 采用ELISA法检测各组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在波长490 nm处测定各样品吸光度值，计算血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.7.3检测大鼠胸主动脉组织MAPK信号通路蛋白磷酸化情况 采用Western blotting法检测各组大鼠胸主动脉组织中ERK1/2、p38、JNK及其磷酸化蛋白表达情况，具体方法如下：液氮中研磨胸主动脉组织，加入组织裂解液裂解，BCA法进行蛋白定量，加5×上样缓冲液煮沸10 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，电泳结束后经聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，ERK1/2、p38、JNK、p-ERK1/2、p-p38及p-JNK一抗(1：1000)稀释液，室温孵育2 h，继以辣根酶标记的二抗(1：5000)稀释液室温孵育1 h，按照ECL试剂盒说明书进行操作，将发光液均匀地滴在PVDF膜上，反应1 min，最后将膜放入暗室压片成像。结果用目的蛋白的灰度值与非磷酸化蛋白的灰度值的比值表示，用Quantity One 软件对显影条带进行分析。

2 结果

2.1大鼠胸主动脉组织病理变化 正常对照组胸主动脉组织内膜、中膜、外膜分界明显，内皮细胞结构完整且排列有序，中膜可见梭形平滑肌细胞，弹力纤维层结构完整无破裂，外膜为疏松结缔组织；模型对照组内膜增厚不光滑、内皮细胞脱落结构不完整，中膜内可见炎性细胞浸润、泡沫样细胞，弹力纤维变性、断裂和崩解，偶见散在钙化灶；辛伐他汀组，葛根素大、小剂量组内膜增厚程度较轻，内皮细胞较为完整，中膜内炎细胞浸润少见、泡沫样细胞少见(图1)。

2.2大鼠血脂水平变化 见表1。与正常对照组比较，模型对照组大鼠TC、TG、LDL-C等均显著升高(均P<0.05)，HDL-C水平显著降低(P<0.05)，与模型对照组比较，辛伐他汀组及葛根素大、小剂量组TC、TG、LDL-C水平均显著降低(P<0.05)，HDL-C水平均显著提升(P<0.05)，但均未达到正常水平；与辛伐他汀组比较，葛根素大、小剂量组TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差异均无统计学意义(P>0.05)，且葛根素大、小剂量组间上述指标水平差异亦无统计学意义(P>0.05)。

2.3大鼠血清TNF-α、IL-6和 IL-1β水平变化 见表2。与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，辛伐他汀组，葛根素大、小剂量组TNF-α、IL-6和 IL-1β水平均显著降低(P<0.05)；与辛伐他汀组比较，葛根素大、小剂量组TNF-α、IL-6和IL-1β水平差异均无统计学意义(P>0.05)，且葛根素大、小剂量组间上述指标水平亦差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4大鼠胸主动脉组织MAPKs磷酸化情况 Western blotting实验结果显示，各组大鼠胸主动脉组织ERK1/2、p38及JNK 3种蛋白表达情况均较为相似，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，但其相应磷酸化蛋白p-ERK1/2、p-p38及p-JNK在各组间的表达均差异较大。与正常对照组比较，模型对照组p-ERK1/2、p-p38及p-JNK蛋白表达水平显著升高；与模型对照组比较，辛伐他汀组和葛根素大、小剂量组p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；辛伐他汀组与葛根素大、小剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，且葛根素大、小剂量组间上述指标水平亦差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

3 讨论

AS是导致冠心病、心肌梗死、缺血性脑卒中等心脑血管疾病的主要病理基础，严重威胁人类健康，是引起全世界死亡率高的主要原因[6]。众多研究认为[7-8]，AS的形成与脂质代谢紊乱密切相关，高脂血症是AS发病的重要危险因素。高脂血症可致内皮细胞损伤，进而促进沉积于内膜下LDL-C被氧化修饰成ox-LDL，巨噬细胞吞噬ox-LDL形成泡沫细胞，并伴随血管炎症、平滑肌细胞增殖、血管钙化及斑块形成[9]。为了更好地应用于临床，本研究采用腹腔注射VD3联合高脂饲料诱导大鼠AS模型，结果显示，模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C等血脂指标水平显著异于正常对照组；HE染色结果显示，模型对照组大鼠胸主动脉内膜增厚、内皮细胞受损，中膜内炎性细胞浸润、泡沫样细胞多见，弹力纤维变性、断裂和崩解，偶见散在钙化灶。以上结果与文献[10-11]报道一致，表明大鼠AS模型复制成功。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.辛伐他汀组；D.葛根素小剂量组；E.葛根素大剂量组。

表1 5组大鼠血清血脂水平比较

Tab.1 Comparison of serum lipid levels among five groups of rats

表1 5组大鼠血清血脂水平比较

组别TCTG正常对照组1.55±0.080.96±0.09模型对照组6.52±0.44①5.23±0.11①辛伐他汀组4.24±0.13②4.33±0.20②葛根素 小剂量组4.30±0.15②4.33±0.15② 大剂量组4.27±0.12②4.31±0.16②组别LDL-CHDL-C正常对照组0.74±0.120.65±0.06模型对照组4.34±0.26①0.32±0.04①辛伐他汀组3.15±0.15②0.45±0.05②葛根素 小剂量组3.20±0.23②0.42±0.04② 大剂量组3.19±0.22②0.43±0.04②

①与正常对照组比较，t=7.022～9.365，P<0.05；②与模型对照组比较，t=7.694～11.215，P<0.05。

①Compared with normal control group，t=7.022-9.365，P<0.05；②compared with model control group，t=7.694-11.215，P<0.05.

他汀类药物是目前广泛应用于临床及动物实验的基础降脂药，其可降低TC、TG、LDL-C水平、升高HDL-C水平，并可改善血管内皮功能，减轻炎症反应，降低粥样斑块内胆固醇及ox-LDL水平、减轻血栓形成等[5，12]。辛伐他汀是他汀类药物中经典药物，故本研究以其作为阳性对照药，观察葛根素对AS大鼠血脂代谢的影响。本研究结果显示，辛伐他汀、葛根素均可显著降低AS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，显著提升血清HDL-C水平，且葛根素调节血脂作用与辛伐他汀显著不明显。

表2 5组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比较

Tab.2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β among five groups of rats

表2 5组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比较

组别TNF-αIL-6 IL-1β正常对照组80.56±6.2440.16±2.3010.36±0.98模型对照组133.52±10.13①60.78±5.90①25.21±2.06①辛伐他汀组98.45±9.41②50.77±4.21②13.65±1.42②葛根素 小剂量组100.19±8.58②50.76±2.32②13.51±1.54② 大剂量组101.74±9.20②48.49±3.84②12.35±1.30②

①与正常对照组比较，t=7.502～11.381，P<0.05；②与模型对照组比较，t=6.308～13.213，P<0.05。

①compared with normal control group，t=7.502-11.381，P<0.05；②compared with model control group，t=6.308-13.213，P<0.05.

越来越多的研究表明[13]，炎症参与AS的发生与发展，炎性因子和免疫细胞参与了AS的病理生理过程。AS斑块处的T淋巴细胞和单核巨噬细胞可过度分泌IL-6、TNF-α及IL-1β等炎性细胞因子，作为炎症和免疫反应的重要递质，上述炎性细胞因子可增强炎症反应、损伤血管内皮细胞，诱导内皮细胞黏附分子表达和释放，增加内皮细胞通透性[5，14]，并可促进平滑肌细胞增殖、迁移及血栓形成，最终导致AS形成和斑块不稳定[15-16]。本研究结果发现，AS模型大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著升高，使用葛根素干预处理后，各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著降低。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.辛伐他汀组；D.葛根素小剂量组；E.葛根素大剂量组；①与正常对照组比较，t=8.011～13.214，P<0.05；②与模型对照组比较，t=7.562～12.383，P<0.05。

MAPKs是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分为ERK、JNK和p38 MAPK三类，是将细胞外信号转导到细胞内引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)所需的一类重要信号系统，在多种心血管系统疾病的发展过程中发挥重要的调控作用[16]。MAPK信号通路在未受刺激时，处于静止状态，受到炎性刺激时，p38、ERK1/2和JNK可经上下游激酶刺激，发生级联磷酸化而激活，参与细胞的增殖、分化、转化及凋亡等细胞过程的调控[17-18]。因此，检测组织细胞p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平，可反映MAPK信号通路激活情况。本研究采用Western blotting法检测大鼠胸主动脉中p38、ERK1/2和JNK等蛋白磷酸化情况，结果显示，AS大鼠胸主动脉组织p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白表达均显著增加，表明AS病理进程中涉及到MAPK信号通路的激活；而葛根素可显著抑制MAPK信号通路中上述相关蛋白磷酸化，且其效果与辛伐他汀相似。提示葛根素抗AS作用机制可能与抑制MAPK信号通路激活有关。

综上所述，大鼠AS病理状态下，血脂代谢异常，血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平升高。葛根素可有效调节TC、TG、LDL-C、HDL-C等异常变化的血脂指标水平，降低AS大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平，并可抑制AS大鼠胸主动脉组织MAPK信号通路中上述相关蛋白磷酸化，抑制p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白表达。以上结果说明，葛根素能够通过调节血脂、降低血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平来发挥抗AS作用，而机制可能与抑制MAPK信号通路激活有关。而上述作用机制可能仅仅是一方面，有关葛根素对AS大鼠治疗作用的深入机制尚需进一步研究。