基于网络药理学研究小儿升麻方对流感病毒性肺炎小鼠的治疗作用机制

刘志东，陈金鹏,，周稼荣，周思雨，刘 毅,，刘素香,，任 涛,，田成旺,*，陈常青,*

1.天津中医药大学，天津 300193

2.天津药物研究院，天津 300301

3.天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300301

4.释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津 300301

流感病毒性肺炎是由流感病毒性上呼吸道感染向下蔓延所致，流感并发的肺炎可分为原发性流感病毒性肺炎、继发性细菌性肺炎和混合性肺炎[1-2]。流感病毒性肺炎多发于老人、儿童等免疫力低下者，早期表现流感症状，病情进展迅速，病死率较高[3]。由于流感病毒的抗原变异能力极强，临床上主要以对症治疗为主，抗病毒等其他治疗手段为辅[4]。中医药对流感病毒性肺炎有较好的治疗作用[5]。小儿升麻方源自孙思邈的《备急千金要方》，由升麻、射干、生姜、陈皮4 味药组成，为治疗热毒、咽塞的经典方药[6]。本研究通过体内实验探究小儿升麻方对流感病毒性肺炎小鼠的治疗作用，并采用网络药理学方法探究小儿升麻方治疗流感病毒性肺炎的作用机制，为其临床应用提供依据。

1 材料

1.1 网络药理学研究材料

中医药整合药理学网络计算研究平台（ TCMIP ， http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/home/login/login.html）；Genecard 数据库（https://www.genecards.org/）；STRING 数据库（https://stringdb.org/cgi/input.pl）；OmicsBean 数据库（http://www.omicsbean.cn/）；Venny 2.1.0 在线软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；Cytoscape 3.7.0 软件。

1.2 动物

普通级昆明小鼠190 只，雌雄各半，体质量18～20 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证号0042219。动物在18～22 ℃，40%～60%湿度的环境中适应性饲养1 周。动物实验遵循天津中医药大学实验动物管理规定，符合3R 原则。

1.3 病毒

FM1 流感病毒株，由安徽省医学科学研究所引进。实验前经鸡胚接种，收集48 h 尿囊液，测定血凝效价（1∶1024），于-70 ℃保存备用。

1.4 药品

小儿升麻方浸膏（每克含生药6.302 g）由天津药物研究院提供，实验前将浸膏配制成质量浓度为1.89 g/mL（以生药量计）的母液。

2 方法

2.1 小儿升麻方对流感病毒性肺炎小鼠的影响

2.1.1 测定小儿升麻方的最大给药量 取小鼠10只，雌雄各半，禁食12 h 后ig 0.5 mL 小儿升麻方母液（47.25 g/kg）。观察7 d，如无死亡，计算小鼠的最大给药量倍数。

最大给药量倍数＝250×小鼠耐受量/成人每日用量

2.1.2 测定FM1 流感病毒尿囊液的半数致死量（lethal dose，LD50） 取小鼠60 只，雌雄各半，随机分为6 个不同稀释倍数（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6）病毒组，每组10只。小鼠在乙醚麻醉下，经鼻滴入0.03 mL FM1 流感病毒尿囊液，观察小鼠死亡情况，第14 天按Reed-Muench 法计算LD50。

2.1.3 分组与给药 根据前期预实验，取小鼠60 只，雌雄各半，随机分为对照组，模型组，小儿升麻方低、中、高剂量（1.75、3.50、7.00 g/kg）组，生理盐水组，每组10 只。将小儿升麻方母液稀释成质量浓度为0.175、0.350、0.700 g/mL 的溶液，分别用作小儿升麻方低、中、高剂量组给药。除对照组和模型组外，各给药组ig 相应药物（10 μL/g），生理盐水组ig 等体积生理盐水，1 次/d，连续6 d。于给药第2 天，除对照组外，其余各组小鼠经鼻滴入0.03 mL FM1 流感病毒尿囊液（尿囊液稀释5244 倍，病毒感染量为15 LD50）。给药结束后，小鼠禁食禁水24 h，称定质量，脱颈椎处死，取出肺组织，测定肺指数。

肺指数＝小鼠肺质量/体质量

2.2 网络药理学研究

在TCMIP 数据库[7]中查找小儿升麻方各药材成分和靶点信息，在Genecards 数据库[8]以“流感病毒性肺炎”为关键词搜索相关靶点，通过Venny 2.1.0 在线软件[9]与小儿升麻方化学成分的靶点映射筛选出共同靶点作为研究靶点。借助OmicsBean 分析平台[10]与STRING 数据库[11]对共同靶点进行基因本体（gene ontology，GO）生物过程分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析。将共同靶点导入STRING 数据库中构建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，利用Cytoscape 3.7.0 软件进行可视化处理，筛选出核心靶点，构建“药材-成分-靶点-通路”网络。

3 结果

3.1 体内抗流感病毒性肺炎实验

3.1.1 小儿升麻方最大给药量的确定 小鼠ig 小儿升麻方（47.25 g/kg）7 d 内未出现死亡，小儿升麻方的给药剂量相当于人临床用量的112.49 倍，表明其安全范围较大、毒性较小。

3.1.2 FM1 流感病毒尿囊液对小鼠的LD50FM1流感病毒尿囊液对小鼠的LD50为4.895，即尿囊液稀释78 660 倍时能使50%小鼠死亡。

3.1.3 小儿升麻方对流感病毒性肺炎小鼠肺指数的影响 如表1 所示，与模型组比较，小儿升麻方高剂量组可明显降低流感病毒性肺炎小鼠肺指数（P＜0.05），表明7.00 g/kg 小儿升麻方对流感病毒性肺炎小鼠有一定治疗作用。

表1 小儿升麻方对流感病毒性肺炎小鼠肺指数的影响Table 1 Effect of Xiaoer Shengma Formula on lung index of mice with influenza virus pneumonia

3.2 网络药理学研究

3.2.1 小儿升麻方中药材、成分和靶点的预测 通过借助TCMIP 数据库，筛选出小儿升麻方化学成分217 个，其中陈皮化学成分44 个、升麻化学成分24 个、射干化学成分25 个、生姜化学成分124个。小儿升麻方的候选靶点共有1098 个。

3.2.2 流感病毒相关靶点的筛选 通过Genecards数据库共搜集到流感病毒性肺炎相关靶点1308 个，与小儿升麻方1098 个候选靶点在Venny 2.1.0 中映射筛选出69 个共同靶点。

3.2.3 共同靶点的GO 分析和KEGG 信号通路富集分析 利用OmicsBean 分析平台对共同靶点进行GO 分析，P＜0.5 前10 条如图1 所示，生物过程主要涉及细胞活化（B 细胞和T 细胞的分化）、细胞对化学刺激的反应、生物过程的负调控等过程；细胞组分主要涉及细胞外泌体、细胞外小泡、细胞外细胞器等过程；分子功能主要涉及RNA 结合、蛋白质结合、杂环化合物结合等过程。

将69 个共同靶点输入到STRING 数据库中，得到88 条通路（错误发生率＜0.01），对其进行KEGG 分析并查阅相关文献，通过OmicsBean 分析平台对错误发生率排名前10 的通路进行可视化处理，如图2 所示，主要有麻疹、结核、军团菌病、百日咳、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、人巨细胞病毒感染、弓形虫病、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、致病性大肠杆菌感染等通路。

图1 共同靶点的GO 富集分析Fig.1 GO enrichment analysis of common targets

图2 共同靶点KEGG 通路富集分析的前10 条通路Fig.2 Top 10 pathways for enrichment analysis of common target KEGG pathway

图3 共同靶点的PPI 网络Fig.3 PPI network of common targets

3.2.4 小儿升麻方靶点PPI分析 将69个共同靶点蛋白输入STRING 数据库，构建PPI 网络。该网络共有68 个节点，483 条相互作用关系，平均度值为14.2。将PPI 网络数据导入Cytoscape 3.7.0 中，度值降序排列筛选出大于平均度值的核心靶点24 个，如图3 所示，包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine-threonine kinase 1，AKT1）、白蛋白（albumin，ALB)、热休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90AA1）、β-肌动蛋白（β-actin，ACTB）、雌激素受体（estrogen receptor，ESR1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF、热休克蛋白8（heat shock protein 8，HSPA8）、α-烯醇酶（α-enolase，ENO1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、前列腺素内过氧化物酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）、细胞色素C（ cytochrome C ， CYCS ）、 白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL1-β）、延伸因子1-α1（elongation factor 1-α1，EEF1A1）等。

为了进一步了解PPI 网络的生物作用，使用Cytoscape 3.7.0 软件对网络进行Cluster 模块分析，共获得4 个Cluster 模块，对4 个模块进行富集分析，如图4 所示，Cluster 1 主要与氮化合物代谢过程的正负调控、细胞凋亡过程、化学反应、代谢过程的负调控等生物过程有关；Cluster 2 主要与谷胱甘肽代谢、癌症中的中央碳代谢、脂肪细胞因子信号通路、IgG Fc 受体（Fc γ receptors，FcγR）介导的吞噬作用等通路过程相关；Cluster 3主要与病毒的转录、翻译有关；Cluster 4 主要与调控细胞生长、DNA 合成、mRNA 转运等生物过程有关。

图4 共同靶点Cluster 模块的PPI 网络Fig.4 PPI network of common target Cluster module

图5 小儿升麻方“药材-成分-靶点-通路”网络Fig.5 “Herbs-compound-target-pathway” network of Xiaoer Shengma Formula

3.2.5 小儿升麻方“药材-成分-靶点-通路”网络构建 小儿升麻方“药材-成分-靶点-通路”如图5 所示，该网络有20 306 条边，且构建网络的节点度分布服从幂分布[P(χ)＝30.660χ-0.947（r2＝0.714）]，表明小儿升麻方网络为无标度网络。特征路径长度2.746，即网络路径长度为3 步，大多数靶点的联系密切，表明该网络具有较快的传播速度和较小的反应时间，具有小世界性质。网络异质性为1.500，平均相邻节点数目6.467，网络中心度0.411，提示小儿升麻方“药材-成分-靶点-通路”网络具有无标度、小范围的结构体系。网络中既存在一个分子与多个靶点的相互作用，也存在不同分子作用于同一个靶点的现象，显示了小儿升麻方多成分、多靶点、多通路的作用特点，初步阐释了小儿升麻方清热解毒的药效物质基础和作用机制。

4 讨论

中医对病毒性肺炎有着丰富的诊治经验[12]，随着中医学和现代医学的交流与相互渗透，中医在流感病毒性肺炎的早期干预、恢复期调理和预后改善均具有明显优势[13]。中医认为病毒性肺炎的病因为外感“疫戾”之气，病位由表及里，多遵从上、中、下三焦和卫气营血传变规律。疫疠之气容易兼夹湿热，侵袭肺卫，尤其是素体脾胃虚弱者；若正不胜邪，邪毒入里化热，伤津耗液，甚者灼营动血，直传心包，发为危候。小儿升麻方中生姜、陈皮性温可散寒，升麻、射干性寒可解郁热。小儿升麻方以疏风寒、清内热、祛燥湿、助化痰、解热毒为主要治法，在疏风解表的基础上，兼顾扶助正气、清热、理气化痰，治疗流感病毒性肺炎。

本研究考察了小儿升麻方对流感病毒性肺炎小鼠的治疗作用，并采用网络药理学方法[14-16]探讨小儿升麻方抗流感病毒性肺炎的作用机制。PPI 网络分析表明，GAPDH、AKT1、ALB、HSP90AA1、ACTB、ESR1、IL-6、TNF、HSPA8、ENO1、CASP3、PTGS2、CYCS、IL1B、EEF1A1 等炎症相关蛋白均具有较高的度值，处于网络的中心位置，可能是小儿升麻方发挥抗流感病毒性肺炎作用的关键靶点。其中，AKT1 可被多种上游细胞因子如血管内皮生长因子等激活，在细胞增殖、存活和凋亡中发挥着重要作用；TNF-α 和IL-6 是重要的促炎因子，参与机体免疫应答和炎症反应等多种病理过程。基于“药材-成分-核心靶点-通路”网络研究发现，升麻中的升麻醇（cimigenol）[17]、升麻素苷（cimicifugoside）、26-脱氧升麻苷（7,8-didehydro-27-deoxyactein），射干中的射干醛（belamcandal）[18]、28-去乙酰基射干醛（28-deacetylbelamcandal）[19]、野鸢尾黄素（irigenin）、鸢尾黄酮甲素（iristectorigenin A）、鸢尾苷元（tectorigenin）、5,6,7,4′-四羟基-8-甲氧基异黄酮（5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxyisoflavone）、5,6,7,3′-四羟基-4′-甲氧基异黄酮 （ 5,6,7,3′-tetrahydroxy-4′-methoxyisoflavone），陈皮中的β-谷甾醇（β-sitosterol），生姜中的龙脑（borneol）等成分，可能通过作用于CYCS、CASP3、HSP90AA1、EEF1A1、膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）、PTGS2、HSPA8、ESR1、IL-6、ACTB、TNF、核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NFKB1）、GAPDH、糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，NR3C1）、ENO1、热休克蛋白β1（heat shock protein β1，HSPB1）、IL-1β 等关键靶点，影响C 型凝集素受体[20]、IL-17[21]、TNF[22]、人巨细胞病毒感染[23]等通路发挥抗炎和免疫调节的作用[24]。研究表明，流感病毒侵入呼吸道上皮细胞后被吞噬，感染细胞识别病毒RNA，激活细胞及体液免疫应答，产生“细胞因子风暴”，导致大范围的组织损伤、全身炎症反应综合征[25-27]。因此，在抗病毒基础上联合免疫调节治疗已成为研究焦点。

综上所述，本研究通过体内抗病毒实验发现小儿升麻方对流感病毒性肺炎有潜在的治疗作用，并采用网络药理学方法揭示了其抗流感病毒性肺炎的药效物质基础、关键靶点及作用通路，发现小儿升麻方可能通过升麻醇、射干醛、野鸢尾黄素、鸢尾黄酮甲素等化学成分，作用于AKT1、TNF、IL-6、ESR1、NR3C1 等关键靶点，调节炎症反应、凋亡、氧化应激等生物学过程，发挥抗流感病毒性肺炎作用，为小儿升麻方的临床应用提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突