小黄皮茎的化学成分及生物活性研究

2021-02-03夏红旻曲延伟张东明

中草药 2021年3期

夏红旻，曲延伟，王亮，郭威，张东明*

1.山东省中医药研究院泰山学者特聘专家岗位国家中医药管理局中药分析重点学科山东省中药质量标准研究重点实验室，山东济南 250014

2.北京协和医学院中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050

3.山东达冠医药科技有限公司，山东济南 250101

小黄皮Clausena e marginataHuang 是芸香科（Rutaceae）黄皮属ClausenaBurm.f.小乔木，分布于云南、广西、海南等地。其根、叶均可入药，具有宣肺止咳、通经活络、行气止痛等功效，用于感冒头痛、风寒咳嗽、胃痛及风湿性关节炎等症的治疗[1]。前期本课题组从小黄皮茎枝95%乙醇提取物的氯仿部位分离到了一系列的柠檬苦素、生物碱、香豆素及木脂素类化合物，并对其进行了多模型药理活性评价，结果表明部分化合物具有良好的抗炎、保肝等活性[2-6]。为继续寻找结构新颖、活性强的单体化合物，为小黄皮的临床应用及资源的合理开发利用提供理论支持，本课题组从其95%乙醇提取物的氯仿部位分离得到11 个化合物，分别鉴定为nordentatin（1）、oxanordentatin（2）、5′-羟基葡萄内酯（anisocoumarin H，3）、7-[(E)-7′-羟基-3′,7′-二甲基-2′,5′-二烯]-香豆素（7-[(E)-7′-hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,5′-dienyloxy]-coumarin，4）、7-羟基香豆素（7-hydroxycoumarin，5）、claulamine A（6）、γ-崖椒碱（γ-fagarine，7）、开环异落叶松脂素（secoisolariciresinol，8）、2-{4-[(1E)-3-hydroxyprop-1-en-1-yl]-2,6-dimethoxyphenoxy}propane-1,3-diol（9）、2-[4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenoxy]-1,3-propanediol（10）、甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基苯甲酸（methyl 2-O-β-D-glucopyranosylbenzoate，11）。其中，化合物1～5 为香豆素类化合物，6 为咔唑生物碱，7 为呋喃喹啉类生物碱，8 为木脂素类化合物，9、10 为苯丙素类化合物，11 为酚酸类化合物。化合物2～4、7～11 为首次从该植物中分离得到。在化合物体外活性评价中，化合物5 和7对DL-半乳糖胺诱导的WB-F344细胞损伤具有一定的保护活性，化合物11 对LPS 诱导BV2 细胞产生NO 具有一定的抑制作用。

1 仪器与材料

Mercury-400 型（美国Varian 公司）；Bruker AV500-III 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL 型质谱仪（安捷伦科技有限公司）；中压制备液相色谱系统（瑞士布琪有限公司）；Shimadzu LC-6AD 型半制备液相色谱仪（日本岛津公司）；制备柱（YMC ODS-A C18，250 mm×20 mm，5 μm，日本YMC 公司）；薄层色谱硅胶GF254和柱色谱硅胶（100～200、200～300 目，青岛海洋化工有限公司）；色谱纯溶剂（美国Fisher公司）；分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

小黄皮药材于2010年8月采自云南西双版纳，经中国科学院西双版纳热带植物园崔景云研究员鉴定为小黄皮C.emarginataHuang 的干燥茎枝，标本（ID-22254）存放于中国医学科学院药物研究所标本室。

2 提取与分离

小黄皮茎18 kg，经干燥、粉碎后，用95%乙醇加热回流提取3 次（每次2 h），减压浓缩至无醇味，得提取物570 g。提取物经硅藻土柱色谱分离，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、丙酮-乙醇（1∶1）、乙醇、乙醇-水（1∶1）进行洗脱，分成7个部位。氯仿洗脱部位（81 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）分离，以石油醚-丙酮（100∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）进行梯度洗脱，得到6 个部位（A1～A6）。其中A3（15 g）采用硅胶柱色谱（200～300 目）粗分，以石油醚-丙酮（100∶0、95∶5、9∶1、85∶15、8∶2、75∶25、7∶3、65∶35、6∶4、55∶45、5∶5）为洗脱剂梯度洗脱，根据薄层色谱分析结果，将相同组分合并后得到5 个组分（A3B1～A3B5）。组分A3B1（4.0 g）先经MPLC分离（30%～90%甲醇，25 mL/min，4 h），再经制备型HPLC 纯化（40%甲醇，8 mL/min），得到化合物1（45 mg）、2（0.8 mg）、3（4.2 mg）、4（8.3 mg）、5（9.5 mg）和6（15 mg）。A3B2（2.8 g）通过MPLC进行粗分（30%～90%甲醇，25 mL/min，3 h），然后用制备型HPLC 分离纯化，38%甲醇溶液为流动相（8 mL/min），得到化合物7（5 mg）。A5（8.1 g）先用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（100∶0→5∶5）为洗脱剂，根据薄层色谱分析结果，将相同组分合并，得到2 个组分（A5B1～A5B2）。组分A5B1（3.2 g）经过MPLC 粗分（10%～90%甲醇，25 mL/min，3 h），再用制备型HPLC 分离（35%甲醇，8 mL/min），得到化合物8（3 mg）。组分A5B2（2.8 g）先用MPLC 分离，10%～90%甲醇为流动相（25 mL/min，3 h），再经制备型HPLC 纯化（35%甲醇，8 mL/min），得到化合物9（4 mg）、10（7 mg）和11（4 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色粉末；ESI-MSm/z335.1[M＋Na]＋。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.11 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),8.11 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),5.71(1H,d,J= 10.0 Hz,H-3′),6.70 (1H,d,J= 10.0 Hz,H-4′),6.22 (1H,dd,J= 17.6,10.8 Hz,H-2′′),4.82(2H,dd,J= 17.6,10.8 Hz,H-3′′),1.56 (6H,s,2′-CH3),1.37 (6H,s,1′′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 159.9 (C-2),109.5 (C-3),140.2 (C-4),106.6 (C-4a),148.4 (C-5),104.1 (C-6),155.5 (C-7),113.8 (C-8),153.7 (C-8a),76.8 (C-2′),128.5 (C-3′),116.6 (C-4′),40.4 (C-1′′),150.0 (C-2′′),107.9 (C-3′′),27.0 (2′-CH3),29.5 (1′′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物1 为nordentatin。

化合物2：淡黄色粉末；ESI-MSm/z329.2 [M＋H]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.12 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.93 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),5.73(1H,d,J= 10.0 Hz,H-3′),6.40 (1H,d,J= 10.0 Hz,H-4′),4.41 (1H,dd,J= 6.4,5.2 Hz,H-2′′),3.74 (2H,m,H-3′′),1.42 (6H,s,2′-CH3),1.50 (3H,s,1′′-CH3),1.26 (3H,s,1′′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 159.8 (C-2),109.9 (C-3),139.2 (C-4),103.0 (C-4a),149.8 (C-5),101.4 (C-6),157.5 (C-7),113.9 (C-8),150.4 (C-8a),78.0 (C-2′),128.8 (C-3′),115.1 (C-4′),42.9 (C-1′′),94.4 (C-2′′),59.6 (C-3′′),27.6 (2′-CH3),27.5 (2′-CH3),26.4 (1′′-CH3),20.8 (1′′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物2 为oxanordentatin。

化合物3：淡黄色粉末；ESI-MSm/z337.3 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.27 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.98 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.60(1H,d,J= 8.8 Hz,H-5),6.92 (1H,dd,J= 8.8,2.0 Hz,H-6),6.96 (1H,s,H-8),4.63 (2H,d,J= 6.8 Hz,H-1′),5.41 (1H,t,J= 6.4 Hz,H-2′),2.19 (1H,dd,J= 13.2,7.2 Hz,H-4′a),2.02 (1H,dd,J= 13.2,6.0 Hz,H-4′b),4.45 (1H,m,H-5′),5.05 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-6′),1.57 (3H,s,H-8′),1.72 (3H,s,3′-CH3),1.56 (3H,s,7′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 160.4(C-2),113.0 (C-3),144.4 (C-4),112.4 (C-4a),129.5(C-5),112.3 (C-6),161.7 (C-7),101.4 (C-8),155.4(C-8a),65.7 (C-1′),120.9 (C-2′),138.8 (C-3′),47.8(C-4′),65.2 (C-5′),129.5 (C-6′),131.4 (C-7′),25.5(C-8′),17.1 (3′-CH3),18.0 (7′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物3 为5′-羟基葡萄内酯。

化合物4：淡黄色油状物；ESI-MSm/z337.2[M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.27(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.97 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.60 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5),6.94 (1H,dd,J= 8.4,2.0 Hz,H-6),6.99 (1H,d,J= 2.0 Hz,H-8),4.65 (2H,d,J= 6.4 Hz,H-1′),5.46 (1H,t,J= 6.8 Hz,H-2′),2.71(2H,d,J= 6.8 Hz,H-4′),5.50 (1H,dt,J= 15.6,6.4 Hz,H-5′),5.58 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-6′),1.14 (3H,s,H-8′),1.70 (3H,s,3′-CH3),1.14 (3H,s,7′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 160.3 (C-2),112.9(C-3),144.4 (C-4),112.4 (C-4a),129.4 (C-5),112.3(C-6),161.7 (C-7),101.4 (C-8),155.4 (C-8a),65.2(C-1′),119.2 (C-2′),141.5 (C-3′),41.4 (C-4′),122.2(C-5′),140.6 (C-6′),68.8 (C-7′),30.1 (C-8′),16.5(3′-CH3),30.1 (7′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物4 为7-[(E)-7′-羟基-3′,7′-二甲基-2′,5′-二烯]-香豆素。

化合物5：黄色粉末；ESI-MSm/z185.1 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.16 (1H,d,J= 9.2 Hz,H-3),7.90 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.49(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.75 (1H,dd,J= 8.4,1.6 Hz,H-6),6.67 (1H,d,J= 0.8 Hz,H-8)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 161.9 (C-2),113.3 (C-3),144.5(C-4),111.0 (C-4a),129.6 (C-5),111.0 (C-6),160.5(C-7),102.2 (C-8),155.6 (C-8a)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物5 为7-羟基香豆素。

化合物6：白色粉末；ESI-MSm/z306.2 [MH]-；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 8.59 (1H,brs,H-4),8.23 (1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),7.22 (1H,t,J=7.6 Hz,H-6),7.44 (1H,t,J= 8.0 Hz,H-7),7.55 (1H,d,J= 8.0 Hz,H-8),3.28 (1H,dd,J= 16.0,3.0 Hz,H-1′a),3.16 (1H,dd,J= 16.4,10.8 Hz,H-1′b),5.05(1H,overlapped,H-2′),5.15 (1H,s,H-4′a),5.03 (1H,s,H-4′b),1.86 (3H,s,H-5′),3.95 (3H,s,1-OCH3),11.84 (1H,brs,NH)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 140.7 (C-1),136.2 (C-1a),116.0 (C-2),127.6 (C-3),119.0 (C-4),123.5 (C-4a),120.8 (C-5),122.9 (C-5a),119.9 (C-6),126.6 (C-7),111.7 (C-8),140.6 (C-8a),26.1 (C-1′),80.0 (C-2′),142.6 (C-3′),113.4 (C-4′),18.3 (C-5′),60.9 (1-OCH3),165.4 (3-C=O)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物 6 为claulamine A。

化合物7：白色粉末；ESI-MSm/z252.0 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 8.05 (1H,d,J= 2.4 Hz,H-2),7.46 (1H,d,J= 2.8 Hz,H-3),7.75(1H,d,J= 8.8 Hz,H-5),7.37 (1H,t,J= 8.0 Hz,H-6),7.16 (1H,d,J= 7.6 Hz,H-7),4.43 (3H,s,4-OCH3),3.94 (3H,s,8-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 144.6 (C-2),105.3 (C-3),103.5 (C-3a),156.2 (C-4),113.5 (C-5),123.6 (C-6),108.4 (C-7),154.3 (C-8),162.6 (C-9a),59.4 (4-OCH3),55.6 (8-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物7 为γ-崖椒碱。

化合物8：白色粉末；ESI-MSm/z385.1 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,methanol-d4)δ: 6.53 (2H,brs,H-2,2′),6.60 (2H,d,J= 8.0 Hz,H-5,5′),6.49(2H,d,J= 8.0 Hz,H-6,6′),2.60 (2H,dd,J= 13.6,6.8 Hz,H-7a,7′a),2.50 (2H,dd,J= 13.6,8.8 Hz,H-7b,7′b),1.84 (2H,m,H-8,8′),3.53 (4H,m,H-9a,9b,9′a,9′b),3.68 (6H,s,3,3′-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物8 为开环异落叶松脂素。

化合物9：白色粉末；ESI-MSm/z307.0 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.76 (2H,brs,H-2,6),6.47 (1H,d,J= 16.0 Hz,H-7),6.33 (1H,dt,J= 16.0,4.8 Hz,H-8),4.33 (2H,m,H-9),3.55(4H,m,H-1′,3′),3.84 (1H,m,H-2′),3.77 (6H,s,3,5-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 132.3(C-1),103.3 (C-2),152.8 (C-3),134.8 (C-4),152.8(C-5),103.3 (C-6),128.3 (C-7),130.0 (C-8),61.2(C-9),59.8 (C-1′),83.2 (C-2′),59.8 (C-3′),55.8 (3,5-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物9 为2-{4-[(1E)-3-hydroxyprop-1-en-1-yl]-2,6-dimethoxyphenoxy}propane-1,3-diol。

化合物10：白色粉末；ESI-MSm/z277.0 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:7.02 (1H,brs,H-2),6.88 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5),6.97 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-6),6.45 (1H,d,J= 16.0 Hz,H-7),6.24(1H,dt,J= 15.6,5.2 Hz,H-8),4.71 (2H,t,J= 5.6 Hz,H-9),3.55 (4H,m,H-1′,3′),4.14 (1H,m,H-2′),3.76(3H,s,3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ:130.2 (C-1),109.6 (C-2),149.6 (C-3),146.8 (C-4),115.5 (C-5),118.8 (C-6),128.3 (C-7),128.5 (C-8),61.4 (C-9),60.0 (C-1′),80.7 (C-2′),60.0 (C-3′),55.3(3-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物 10 为 2-[4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenoxy]-1,3-propanediol。

化合物11：白色粉末；ESI-MSm/z337.1 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.25 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-4),7.08 (1H,t,J= 7.6 Hz,H-5),7.51(1H,t,J= 8.4 Hz,H-6),7.62 (1H,d,J= 7.6 Hz,H-7),4.89 (1H,d,J= 6.8 Hz,H-1′),3.15～3.26 (4H,m,H-2′～5′),3.69 (1H,dd,J= 11.2,4.8 Hz,H-6′a),3.57(1H,m,H-6′b),3.79 (3H,s,1-COOCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ: 166.2 (C-1),121.0 (C-2),155.9 (C-3),116.1 (C-4),133.1 (C-5),121.4 (C-6),130.1 (C-7),100.7 (C-1′),73.1 (C-2′),76.3 (C-3′),69.4(C-4′),76.9 (C-5′),60.4 (C-6′),51.8 (1-COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物11 为甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基苯甲酸。

4 活性筛选

4.1 保肝活性筛选

将WB-F344 细胞置于DMEM 培养基（含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，pH 值为7.2～7.4），在37 ℃、5% CO2下生长。以培养基将细胞分散，使成为密度为1×105个/mL 的细胞悬液，以每孔0.1mL 接种于96 孔板。将细胞分为4 组，即对照组、模型组、实验组和阳性对照组，24 h 后，实验组加入待测单体化合物（1～11），阳性对照组加入阳性对照药双环醇，给药浓度均为10 μmol/L，1 h 后，除对照组外，其余各组分别加入DL-半乳糖胺，终浓度为50 mmol/L。继续培养24 h 后换含有MTT（0.5 mg/mL）无血清的培养基，培养4 h，吸取培养液，加入DMSO 振荡使溶解，于490 nm 下测定吸光度（A）值。研究结果显示，化合物5 和7 对DL-半乳糖胺诱导的WB-F344 细胞损伤具有一定的保护活性，在浓度为10 μmol/L 时肝细胞的存活率分别为49%和48%，与模型组比较差异具有显著性，结果见表1。

细胞存活率=(A实验－A空白基质)/(A对照－A空白基质)

4.2 抗炎活性筛选

将BV2 细胞置于DMEM-F12 培养基（含10%新生牛血清），在37 ℃、5% CO2、100%相对湿度下生长。将其接种到96 孔板中（2×104个/孔），并分为4 组，即对照组、模型组、实验组和阳性对照组，24 h 后，实验组加入不同浓度的受试化合物（1～11），阳性对照组加入不同浓度的阳性药姜黄素（10.0、1.0、0.1 μmol/L，每个浓度3 个平行孔），1 h后，除对照组外，其余各组分别加入LPS（终质量浓度为300 ng/mL），继续培养24 h，收集培养基上清100 μL，加入等体积Griess 试剂，室温静置20 min，蒸馏水调零，于酶标仪上测定540 nm 处A值，以所测样品中NO2-的浓度来反映NO 的浓度。结果显示，化合物11 对LPS 诱导的BV2 细胞释放NO具有较好的抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）值为8.5 μmol/L，其他化合物的IC50值均大于10 μmol/L，阳性对照姜黄素的IC50值为0.5 μmol/L。