肝脏常温机械灌注修复及评估系统的研制

刘雯雁 ，刘锋锋，吕毅，汤博，马涛，闫炀，郑云巧，郑幸龙,

1 西安交通大学第一附属医院 血液净化科，西安市，710061

2 西安交通大学第一附属医院 精准外科与再生医学国家地方联合工程研究中心，西安市，710061

3 西安交通大学第一附属医院 心血管外科，西安市，710061

4 西安交通大学第一附属医院 麻醉手术部，西安市，710061

0 引言

肝移植仍是目前治愈终末期肝病的唯一有效手段。目前我国肝移植供肝的主要来源为公民心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD），其中边缘供肝的使用一定程度上拓展了供肝的来源，但其对缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）的耐受能力明显减弱[1]。常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）能够在生理温度下为肝脏持续提供氧气和营养物质，并排出代谢废物，改善器官保存期间的能量代谢状态[2-3]。大量动物实验及临床研究提示NMP可有效减轻移植肝IRI，促进术后肝功恢复[4-5]，甚至可减少术后缺血性胆道狭窄的发生率[6]及修复脂肪供肝[7]。

基于此，本团队设计并研制了肝脏常温机械灌注修复及评估系统，在灌注修复供肝的同时对肝功能进行评估，评估供肝质量是否达到肝移植要求，或者经过修复后是否达到肝移植要求。

1 设计思路

目前，传统的器官保存方式仍是静态冷保存，然而越来越多的证据证实即使持续处于4oC，仍在进行大约5%的代谢，这就会造成ATP储备减少且持续产生有害的代谢产物，导致供肝质量受损。传统的保存方式已不能满足DCD供肝保存需求。为解决临床困境，我们团队研发了肝脏常温机械灌注修复及评估系统，由肝脏常温机械灌注装置、荧光成像系统及组织测氧仪组成。常温机械灌注装置持续在生理温度下为肝脏提供氧气和营养物质，维持细胞功能，减轻炎症反应，达到保护及修复的目的，荧光成像系统通过激发并识别灌注液中吲哚菁绿（indoeyanine green,ICG）的荧光，并在屏幕上成像来实时评估供肝微循环情况及肝细胞代谢功能，组织测氧仪可以实时监测肝脏氧分压变化评估细胞氧供状态。同时，通过灌注屠宰场获取的猪肝初步验证了系统的稳定性。

2 基本结构

2.1 肝脏常温机械灌注修复系统

图1 肝脏常温机械灌注修复系统组成Fig.1 Components of liver normothermic machine perfusion repair system

系统由三个模块组成，分别为灌注模块、氧合模块及监测控制模块（见图1）。灌注模块包括：蠕动泵（BQ50-1J保定兰格），用于提供动脉循环动力；储肝容器，用于放置肝脏；第一动脉循环管路，入口端与储肝容器的出口端连通；第二动脉循环管路，入口端与恒温氧合装置的第一出口端连通，出口端延伸至开放式储血容器内，用于与放置在储肝容器内的供肝的肝动脉连通；静脉循环管路，入口端与恒温氧合装置的第二出口端连通，出口端延伸至储肝容器内，用于与供肝的门静脉连通。主要功能为肝脏动脉及门静脉提供双重灌注，模拟在体状态下的血液循环。氧合模块包括：储液罐，用于储存灌注液，内部设置有液位传感器，用于监测储液罐内的液位；变温水箱，有热水出口和回水口，热水出口和回水口分别与膜式氧合器内的热交换管的两个端口对应连通以使变温水箱内的热水循环流过热交换管以将流过膜式氧合器血液加热至预设温度；膜式氧合器（Maquet），用于氧合灌注液，为供肝提供富氧灌注液，入口端与第一动脉循环管路的出口端连通将储肝容器的血液输送至膜式氧合器；氧气瓶，用于储存氧气，在器官转运途中也可为灌注液提供氧合条件。主要功能为利用膜式氧合器对灌注液中的红细胞进行氧合，并对灌注液加温，为肝脏提供充足的氧气，满足肝细胞代谢需求。监测控制模块包括：流量计，用于检测动脉循环管路及静脉循环管路的灌注液流量；压力传感器，用于检测动脉循环管路及静脉循环管理的灌注压力；流量控制阀，用于稳定动脉循环管路及静脉循环管路灌注液流量在设置范围内，当流量超过设定值时，流量阀启动，压迫管道，通过减小管径来降低流量；控制显示屏，控制器获取流量计、压力计、液位传感器的监测信号，控制器与驱动器连接，根据相应的监测信号通过驱动器控制蠕动泵、变温水箱、流量控制阀启动、停止或进行相应的控制动作，同时控制器与显示屏连接能够将各种监测信号发送至显示屏进行显示，并可通过显示屏调节各项控制参数。主要功能为实时监测灌注过程中门静脉、肝动脉的流量及压力，并稳定灌注流量与压力在一定范围内。

2.2 程序处理流程

系统开机启动后，初始化完所有的硬件设备，通过主控制台设置温度、血液流量、压力阈值、蠕动泵转速等参数。点击启动按钮系统开始运行，读取液位传感器信息，判断水位达到指定容量，控制继电器开启电加热管电源开始水箱加热，水恒温到设定值。启动循环泵，运行加热循环系统，通过膜肺将血液加热至设定值。连接灌注肝脏，启动蠕动泵开始系统血液循环，实时监测流量与压力，调整流量控制阀或蠕动泵转速保证血液流量及压力均在要求范围之内。串口实时获取温度、压力传感器的数据解析并计算处理，定时器实时获取计数脉冲并计算得到流量（见图2）。

图2 程序处理流程Fig.2 Program treatment process

整个系统中，肝动脉端流量主要依靠蠕动泵驱动，静脉端流量主要依靠储液罐与储肝容器之间的高度差通过重力驱动。系统的流量反馈调节依靠流量控制阀实现精准控制。蠕动泵转速设置在430 r/min以维持系统基本流量，通过第二动脉循环管路中流量控制阀挤压管道以实现对储液罐液面及肝动脉流量的控制。同时，通过调节静脉循环管路中流量控制阀的松紧程度以实现门静脉灌注的流量控制。亦可手动通过显示屏控制调整蠕动泵泵速，然后经流量计反馈系统自动调整流量控制阀松紧度，以确保流量符合要求。灌注过程中门静脉流量维持在1 000～1 200 mL/min，肝动脉流量维持在200～400 mL/min，肝动脉压力维持在65～75 mmHg（1 mmHg=133.32 Pa）。若储血罐液面水平低于警戒线或肝动脉压力高于设定阈值，系统将报警，蠕动泵随之停转。

2.3 供肝评估系统

该评估系统由荧光成像系统和组织测氧仪组成，见图3(a)，以实现对供肝的实时功能评估。荧光成像系统基于肝细胞可摄取代谢ICG并由胆汁排出的特性，通过785 nm近红外光激发，产生830 nm更长波段的近红外光而实现定位，通过观察灌注过程中肝脏及胆道系统成像的变化可评估微循环灌注效果及肝细胞代谢功能。荧光成像系统包括：激发器，在距离肝脏8～12 cm处发射激光，激发灌注液中的ICG；体外图像处理单元，CCD相机捕捉肝脏组织的荧光图像，通过传像束组件将图像传输至数据处理中心，并在显示器中显示肝脏荧光图像。激发器和CCD相机集成于手持式探头中。组织测氧仪（OxyLiteTM，英国Oxylite公司）包括：光纤氧微传感器，利用光学荧光技术实现组织氧分压的定量测定及温度测定；信号采集器，将采集到的生物学信号转化为电信号；显示屏，可实时显示组织氧分压及温度。将传感器插入肝组织，可实时监测肝组织中的氧分压及温度变化，见图3(b)。荧光成像系统和组织测氧仪分别为两套独立系统，各自配有显示器，ICG成像结果，见图3(c)。

图3 供肝评估系统Fig.3 Assessment system of donor liver

3 肝脏灌注实验

利用屠宰场获取的猪DCD肝脏（n=10）进行设备的可行性验证实验，每个供肝离体灌注时间为6 h。在屠宰场获取猪肝并行门静脉及肝动脉插管，灌注生理盐水冲出肝脏内残留血液及血栓，同时行胆总管插管以方便留取胆汁。灌注液为稀释猪全血（乳酸钠林格液稀释，灌注液成分配比仍需后续实验调整），运行过程顺利，关键参数门静脉流量可维持在1 000～1 200 mL/min，肝动脉流量维持在200～400 mL/min，肝动脉压力维持在65～75 mmHg(1 mmHg=133.32 Pa)。在开始灌注20 min内即可见胆汁生成，并持续引流，胆汁生成量约（10.2±8.7）mL/h。对于供肝的评估，在灌注初始，灌注液中加入20 g ICG，通过荧光成像系统和组织测氧仪可实时观察肝脏表面荧光变化及组织氧供变化情况。图3(c)所示为一例供肝离体灌注时的情况，随着灌注的进行，猪DCD供肝逐渐显影，灌注22 s时肝门部显影，52 s时左外叶大部分显影，至10 min 7 s时全肝呈颗粒状花斑显影。说明供肝的微循环通畅，并具备代谢功能。将氧分压感受器探头插入肝组织中，可见随着灌注时间的延长，组织温度维持在37oC左右且氧分压逐渐升高，说明肝脏常温氧合机械灌注效果良好（图3(b)）。由此证明本系统离体灌注DCD肝脏具备一定可行性并且安全有效。

4 小结

目前国外已报道用于临床试验的肝脏常温机械灌注系统主要有：OrganOx metra[5](英国OrganOx公司)，Organ Care System (OCS) Liver[8](美国Andover公司)，Liver Assist®[4]（荷兰Assist公司）和Cleveland NMP[9]设备（美国Cleveland Clinic公司）。这些设备不仅价格昂贵，且多数实验中心难以购入，限制了供肝保护修复方向的研究。国内亦有中心自主研发相关设备。本团队研发的灌注系统不仅可实现离体肝脏的常温氧合机械灌注，并且可实时监测灌注压力及流量，通过反馈系统自动控制，及时调整泵速，将灌注压力及流量维持在设定范围内，具备一定的自动化。与此同时，本系统配有荧光成像系统及组织测氧仪，实现了肝脏部分代谢功能的实时监测。通过对灌注液的生化学检查，可在移植前进一步评估供肝功能。

现有研究中，NMP在保护DCD肝脏中表现突出。NASRALLA团队[4]临床随机对照研究发现与传统静态冷保存相比，NMP可显著降低移植术后肝酶的峰值水平，同时供肝损伤率降低50%，平均离体保存时间延长54%。国内中山大学何晓顺团队[10]利用 NMP提出无缺血肝移植概念，术后 30 d总体生存率达100%。但是，目前灌注过程中对供肝“生存能力”及“可移植性”的评估，主要都集中在灌注液AST、ALT、LDH水平，或肝脏大体形貌，缺少直接证据和对供肝的实时评估。本系统实现了在灌注过程中即对供肝进行肝功能的评估，ICG荧光成像不仅可以评估微循环通畅程度，还可以通过观察胆汁的荧光强度来评估肝细胞的代谢分泌功能，未来这一评估可以做到定量评估，更加准确。同时，肝脏组织氧分压的测定可以评估肝组织耗氧情况，反映肝细胞功能恢复水平。实时评估系统有望指导DCD供肝的使用，明确灌注修复时间，避免过度灌注情况的发生，以及预测预后，早期指导用药。系统现可以稳定运行并实现上述评估功能，其有效性还需进一步移植实验来验证。