中国乳嘴衣属地衣分类学研究
2021-02-03姚宗廷蒋淑华贾泽峰
姚宗廷，蒋淑华，贾泽峰
(1.聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059；2.中国科学院 微生物研究所 真菌学国家重点实验室，北京 100101)
地衣是由真菌和藻类或蓝细菌共生所形成的复杂群落，在该共生系统中，起主要作用的为真菌，真菌几乎决定了其特征结构[1-2]。乳嘴衣属地衣(Trypethelium)隶属于真菌界(Fungi)子囊菌门(Ascomycota)座囊菌纲(Dothideomycetes)乳嘴衣目(Trypetheliales)乳嘴衣科(Trypetheliaceae)。该属主要分布在热带地区，树皮生，通常具有颜色鲜艳的假子座(pseudostromata)[3]。近年来，随着分子生物学的发展，发现该属呈现出更丰富的物种多样性，被证实为非单系类群[4]，但是对于该属的解剖学特征目前了解尚不完全[3]，这也为该属的分种带来了一定的困难。作者在研究中发现该属的模式种乳嘴衣种内差异较大，但经过分子数据的验证，这些标本均为乳嘴衣种。
目前国外对乳嘴衣属研究较多，而对于中国乳嘴衣属的研究相对匮乏，更缺乏系统性的研究。鉴于此，本文通过开展中国乳嘴衣属地衣的系统分类学研究，阐明乳嘴衣属地衣在中国的物种组成及分布，期望为中国热带、亚热带地区地衣物种多样性保护提供科学依据。
1 乳嘴衣属地衣的研究概况
1804年，Sprengel以乳嘴衣为模式种建立了乳嘴衣属，但是一直以来，关于乳嘴衣属的界线划分问题备受争议。早期许多地衣学家提出和扩展了该属的分类方案[5-6]，但当时的分类系统存在一定的人为因素，这会导致属的多源性，但考虑到表型特征尚未得到分子学数据的验证，所以当时并没有进行正式的分类学上的改动。之后，2009年Nelsen等[4]利用分子数据证实了该属的非单系性，这也进一步证实了需要修订该属的分类学界线。随后Nelsen等[7]于2014年对乳嘴衣科进行系统发育学分析时发现，除乳嘴衣组外，该属大多数物种隶属于Astrothelium分支，且子囊孢子为菱形，因此被划分为Astrothelium属。乳嘴衣组内的成员与该属内其他成员的主要不同在于孢子腔的形状[7]，Luangsuphabool等[8]的研究揭示，对于区分乳嘴衣组内的成员T.eluteriae，T.platystomum和T.subeluteriae，除了传统的分类学特征之外，次级代谢产物也是重要的特征。根据IndexFungorum记载，目前世界范围内报道该属约120种，根据《中国地衣综览》中国报道有5种，主要分布在台湾[9-12]、江苏[13]、上海[13]、浙江[13]、香港[14-16]、福建[12]和云南[3]等地区。
2 材料与方法
2.1 实验材料
本研究所用的55份乳嘴衣标本采自广东省，现保存于聊城大学地衣标本室(LCUF)。
2.2 表型分析
表型特征在奥林巴斯SZX16和TEELEN XTL-207A解剖显微镜下观察并拍照。解剖特征在奥林巴斯BX53复合显微镜下进行检查和拍照.用K(10%氢氧化钾水溶液)、C(次氯酸钙水溶液的饱和溶液)和P(95%乙醇中对苯二胺的饱和溶液)测试皮层和髓层的化学成分。地衣次生代谢物用标准薄层色谱法检测，使用C系统[17-19]。
2.3 基因型分析
2.3.1 DNA的提取扩增和测序
采用十六烷基二甲基溴化铵法(CTAB法)从55份乳嘴衣属标本的子囊组织中提取基因组DNA[20]，并PCR扩增核糖体RNA基因区，包括内转录间隔(ITS)和大亚基rDNA(LSU)。扩增引物分别为ITS4/ITS5[21-22]和AL2R/LR6[23-24]。25 μL的反应体系包括引物各1 μL，2 μL基因组DNA，8 μL ddH2O和13 μL 2×Taq PCR MasterMix®。热循环条件包括：(1)ITS：预变性95 °C 5 min；34个循环包括94 °C 30 s，52 °C 30 s，72 °C 60 s；最后72 °C延伸600 s。(2)LSU：预变性94 °C 300 s，35个循环包括95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 60 s；最后72 °C延伸600 s。目的产物经1%琼脂糖凝胶电泳确认，并由Majorbio(上海)进行测序。序列信息见表1。
表1 构建系统发育树所用的地衣标本
2.3.2 系统发育学分析
将新测得的ITS和LSU序列与GenBank中下载的乳嘴衣科其他11条序列(表1)使用MEGA软件进行比对，以隶属于Pleosporales的Arthopyreniasalicis为外群[25]，利用MEGA7软件进行系统发育学分析[26]。采用基于Tamura-Nei模型的最大似然法构建系统发育树[27]，bootstrap值设为1000，相关分类单元聚集在一起的树百分比显示在分支旁边，如图1所示。
注：红色字体表示的样本为作者测序，其余为GenBank中下载序列。
3 结果分析
由图1构建的ML系统发育树可以看出，Trypethelium、Marcelaria及Astrothelium属各自形成单独的分支。乳嘴衣属分支具有97%的较高支持率，主要由乳嘴衣和T.subeluteriae组成。与该属关系最近的类群是Marcelaria，这与Aptroot等[3]报道的结果一致，但与Marcelaria属的区别在于后者子囊壳具较宽的小孔和较大的砖壁型子囊孢子。
4 描述和讨论
4.1 乳嘴衣(图2)
图2 乳嘴衣Trypethelium eluteriae(凭证标本GD19024)
TrypetheliumeluteriaeSpreng., Anleit.Kennt.Gew.3: 350(1804)
地衣体具皮层，橄榄绿至微黄色，光滑至不平坦，或具有疣状突起。子囊壳顶端小孔，可见小点或较为宽阔，埋生于假子座中。假子座1～2 mm，突出至固着，浅棕色至深棕色，除小孔外，覆盖有黄色色素，内部通常具有黄色色素。盘被除小孔外其余碳化，33～57 μm，子实层清晰，孢子9～13隔，(37～52 μm)×(8～11μm)，无色透明。
化学：地衣体UV-，K-；假子座 UV+ 红色，K+ 紫色，具有黄色的蒽醌类物质。
基物：树皮。
研究标本：广东深圳市，大鹏国家地质公园，50 m，2019.1.17，刘飞月GD19036、GD19020、GD19024、GD19004、GD19049、GD19033。广州市，中国科学院华南植物园，澳洲植物园，26 m，2019.01.20，姚宗廷GD19274、GD19265、GD19272、GD19267、GD19275、GD19269、GD19266；北门附近，22 m, 2019.01.21，姚宗廷GD19356；沙漠植物室，42 m，2019.01.21，刘飞月GD19305、GD19306、GD19307；西门处，23 m，2018.01.20，李敏GD19240、GD19241、GD19252、GD19226、GD19223、GD19251、GD19255、GD19239、GD19257、GD19253、GD19249；山茶园，27 m，2019.01.21，姚宗廷GD19293；棕榈园，65 m，2019.1.18，刘飞月GD19190、GD19206、GD19181、GD19208。深圳市，仙湖植物园，龙尊塔附近，102 m，2019.1.18，姚宗廷GD19153、GD19154、GD19151、GD19143、GD19144、GD19177、GD19172、GD19161、GD19141；综合楼附近，58 m，2019.1.18，姚宗廷GD19109、GD19104、GD19106、GD19105；木兰园，104 m，2019.1.18，姚宗廷GD19130、GD19335、GD19339、GD19125、GD19348、GD19347、GD19128、GD19127、GD19126。
分布：泛热带地区[3]。上海[13]、江苏[13]、浙江[13]、香港[14-16]和台湾[9-10]。
讨论：乳嘴衣是乳嘴衣属的模式种，以该种为中心形成的单系类群为乳嘴衣组，代表了狭义乳嘴衣属Trypetheliums.str.。该组主要是由几个树皮生物种组成，通常会产生假子座状的子囊壳，假子座含有蒽醌类色素，也通常被蒽醌类色素覆盖。在对中国乳嘴衣属的研究中，我们发现，该种表型极具多样性，地衣体光滑至不平坦，或具有疣状突起，子囊壳小孔可见小点，或较宽阔，周围有黑色的边缘(子囊壳露出来的部分)，子囊孢子无色透明，横隔型，横隔处不收缩。但是这些物种在表型上的微小差异均为种内变异，其分子数据差异也较小。该种在化学成分上也具有较大的多样性，Thrower[16]1988年报道了该种在香港的分布，在研究标本中含有黑茶渍素，但是本文研究的广东标本中不含黑茶渍素。中国之前报道乳嘴衣的两变种，其中一变种为聚球变种[T.eluteriaev.conglobatum(Ach.)Zahlbr.]，报道自中国台湾[9,11]；另一变种为柠檬变种[T.eluteriaev.citrinum(Eschw.)Müll.Arg.]，Brotherus[28]1929年报道了中国广东的该变种。根据Index Fungorum记载，该变种现被归入乳嘴衣。由于该种的形态特征多样，因此作者在文中不处理为变种。
4.2 白色乳嘴衣
TrypetheliumepileucodesNyl., Lich.Japan.: 116(1890)
地衣体壳状，橄榄绿至黄棕色，光滑至不平坦。子囊壳顶端小孔，明显的假子座状。假子座0.5～1.5 mm宽，迸出，白色，有黑色的小孔，假子座不含有色素色。子实层清晰，子囊8孢，双囊壁，孢子双列排布。孢子无色透明，梭形，横隔型，5～9(～13)隔，(30～60)μm×((5～)8～13)μm。
化学：地衣体和假子座UV-，K-，未检测到化学物质。
基物：树皮。
分布：泛热带地区[3]。香港[14]。
讨论：该种因假子座表面白色，不含有蒽醌类物质而易与其他种区分，孢子5～9(～13)隔，(30～60)μm×((5～)8～13)μm。
4.3 台湾乳嘴衣
TrypetheliumformosanumZahlbr., Feddes Repert.31: 204(1933)
地衣体壳状，树皮生，暗棕色，有淡白色斑点，光滑。子囊壳小孔浅黑色或略为白色。假子座与地衣体同色，2 mm宽，基部收缩，内部暗棕色，K-。子实层清晰，子囊8孢，孢子无色透明，纺锤形，两端圆钝，胞室双凸透镜状或几乎圆形，3隔，(20～30)μm×(7～8)μm。
基物：树皮。
分布：台湾[9,11-12]。
讨论：该种与斑点乳嘴衣相近，但在孢子特征上因该种孢子3隔，较小而与后者有明显区别。
4.4 斑点乳嘴衣
TrypetheliumleprosulumZahlbr., Annls Mycol.30: 429(1932)
地衣体壳状，树皮生，深暗色，略有斑点或粉末。子囊壳顶端小孔，埋生在假子座中。假子座颜色与地衣体同色，形状不规则，固着，几乎成半球形，基部不收缩。子实层清晰，子囊8孢，孢子无色透明，梭形或指状，顶端狭窄或圆钝，圆形腔，7～9隔，(40～50)μm×(6～8)μm。
基物：树皮。
分布：福建[12]。
讨论：该种孢子大小与白色乳嘴衣相近，但是二者在地衣体的特征上有明显的区别。
4.5 板孔乳嘴衣
TrypetheliumplatystomumMont., Annls Sci.Nat., Bot., sér.2 19: 72(1843)
地衣体具皮层，橄榄绿至微黄棕色，光滑至不平坦。子囊壳顶端具有小孔，明显的假子座状。假子座0.8～1.5 mm，突出，乳白色，颜色通常比地衣体白，小孔通常融合，周围有橙色色素。子实层清晰，子囊8孢，孢子无色透明，梭形，横隔型，12～18隔，(55～75)μm×(8～15)μm。
化学：地衣体UV-，K-；假子座顶部UV+红色，K+紫色，具有橙色蒽醌类物质。
基物：树皮。
分布：泛热带地区[3]。云南[3]。
讨论：在中国已知种中，该种较明显的特征是假子座小孔周围有一薄层橙色色素覆盖，且孢子比其余4种孢子稍大。
5 中国乳嘴衣属检索表
1a.孢子3隔，(20～30)μm×(7～8)μm
T.formosanum
1b.孢子大于3隔
2
2a.假子座白色具有黑色的小孔，孢子5～9(～13)隔，(30～60)μm×((5～)8～13)μm
T.epileucodes
2b.假子座非白色
3
3a.小孔通常融合成叶状，周围覆盖有一薄层橙色色素，孢子12～18隔，(55～75)μm×(8～15)μm
T.platystomum
3b.小孔周围无橙色色素覆盖
4
4a.子囊孢子9～13隔，(37～52)μm×(8～11)μm
T.eluteriae
4b.子囊孢子7～9隔，(45～50)μm×(6～8)μm
T.leprosulum
6 结论
乳嘴衣属是一个严格的热带属，国内对于该属的研究相对匮乏且缺乏系统性。乳嘴衣属作为乳嘴衣科的模式属，与其他属明显的区别是孢子类型以及圆形至椭圆形的腔。该属的模式种乳嘴衣种内变化较大，所以在之后对乳嘴衣属的研究应该在系统发育的框架之中，结合形态、解剖和化学特征来进一步完善属的概念，寻求更自然的属的划分界限。
