基于BATMAN-TCM在线分析平台的浙贝母-瓜蒌配伍治疗慢性阻塞性肺病的网络药理学研究

曹铭晨，徐龙，辛兆洋，方孟香，邢晓敏，陈萧，汪川，魏欣欣，任炜*

(1.青岛大学附属医院，山东 青岛 266000；2.西海岸新区第二中医院，山东 青岛 266400)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种进行性的以不可逆气流受限为特点的慢性炎症性疾病，其高患病率和病死率成为目前世界范围内重要的公共卫生问题之一[1-3]。COPD本质是复杂的慢性炎性过程，包括气道中性粒细胞炎症、氧化应激、肺间质T细胞浸润和反复感染等[1]。目前COPD治疗中常用支气管舒张剂、糖皮质激素等，短期内可有效缓解症状并减少急性加重次数，但长期用药引发的副作用如耐药性、多重感染、消化道溃疡、免疫力低下、骨质疏松等问题不容忽视[2]。中医对COPD的治疗具有丰富的经验，认为此病属“喘证”“肺胀”“痰饮”范畴，是由于肺、脾、肾功能失调导致津液代谢失常、水液停聚于肺部而形成的一种病变，临床以咳嗽、咳痰、喘息等为主要症状[3]。浙贝母-瓜蒌(Fritillariae Thunbergii Bulbus-Trichosanthis Fructus, FTB-TF)配伍是治疗肺部疾病常用的药对，浙贝母主入肺经，具清热化痰散结、润肺止咳之功，瓜蒌甘寒而润，善祛痰散结、清热涤痰、利气润燥，与浙贝母相须为用，增强清润化痰而止咳，但是这一药对在COPD治疗中的分子机制仍不明确。

中药复方具有多成分-多靶点-多通路协同作用的特点,网络药理学以系统生物学为基础，整合药物、生物学数据库，应用生物信息学手段构建药物-基因-靶点-疾病的网络模型，从生物网络的系统水平预测分析中药复方的可能作用机制，与中医药整体观念、组方配伍及中药多成分-多靶点调控的特点不谋而合[4]。本文基于中药分子机理的生物信息学分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)在线分析平台，应用网络药理学的方法探索浙贝母-瓜蒌配伍在COPD治疗中的分子作用机制。

1 研究工具

基于BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[5]获取浙贝母-瓜蒌的主要成分信息并预测可能的相互关系靶点的基因信息；基于中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[6]获取浙贝母-瓜蒌主要成分的药动学参数；应用GeneCards数据库检索并筛选COPD的靶点；应用Cytoscape 3.7.1软件[7]构建化合物-疾病-靶点相互作用网络；基于DAVID(the database for annotation,visualization and integrated discovery)[8]、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[9]、STRING数据库[10]、R语言包3.5.1[11]进行通路富集分析。

2 研究方法与结果

2.1 基于BATMAN-TCM预测浙贝母-瓜蒌治疗COPD的潜在靶点

BATMAN-TCM是一款中药成分分子机制的生物信息学分析工具，其预测模型基于化学结构(包括基于FP2指纹图谱和基于官能团的相似度评分)，副作用，解剖、治疗和化学(anatomical, therapeutic and chemical, ATC)分类系统，药物诱导相似性来衡量药物-相似性基因表达和化学-化学关联的数据挖掘评分；基于蛋白质序列、蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络中的紧密度和基因本体(gene ontology，GO)功能注释评分来预测蛋白质-蛋白质相似性；选择最小冗余最大相关性(mRMR)特征之后，最终集成ATC-GO, FP2-closeness, STITCH-sequence, expression-closeness, ATC-sequence, functional_group-sequence, functional_group-GO 和side_effect-sequence 8个特征参数，采用最大似然比检验(likelihood ratio test,LR)用作最终预测分数，根据预测得分递减的顺序对所有候选蛋白质排名，评分较高的蛋白质视为潜在药物靶标，预测模型预测性能可信度较高[1]。

预测相关参数设置如下：

(1)选择输入类型：中草药或中草药清单；

(2)中草药或中草药清单(拼音/拉丁语/英文名，每行一种)：瓜蒌和浙贝母；

(3)输入预测分数的最低限度：20；

(4)Benjamini-Hochberg多元检测校正后的P值(调整后的P值)：0.05。

预测得到浙贝母-瓜蒌各活性成分相关的target name、gene、fit score等参数，筛选得到BATMAN-TCM相似度评分大于50的关键靶点共418个，涉及活性化合物31个。

GeneCards是一个整合了125个包括基因组、转录组学和蛋白质组学等基因数据库的综合性可检索数据库，分别以关键字“chronic obstructive pulmonary diseases”“COPD”筛选COPD相关的靶点基因信息，剔除相同靶点后得到疾病关键靶点1878个，应用R语言软件制作疾病-药物靶点的VENN图(图1)，VENN图显示浙贝母-瓜蒌涉及205个靶点与COPD相关，占关键靶点数的49.5%，提示浙贝母-瓜蒌在COPD的治疗中可能存在一定的应用价值。浙贝母-瓜蒌的成分中涉及靶点的活性化合物21个，检索TCMSP数据库并列出相关化合物的药物学参数(表1)。

图1 浙贝母-瓜蒌和COPD的靶点基因VENN图

表1 浙贝母-瓜蒌活性成分及其药动学参数

2.2 构建浙贝母-瓜蒌治疗COPD的化合物-靶点网络

将2.1节筛选的浙贝母-瓜蒌活性成分及相关靶点信息导入Cytoscape软件，构建化合物-疾病-靶点网络。其中节点(node)代表化合物、基因、蛋白质等靶点，节点与节点之间的连接(edge)代表相互作用，构建的化合物-疾病-靶点网络(图2)共包含435个节点，其中组蛋白脱乙酰基酶2(histone deacetylase 2, HDAC2)、重组人乙醇脱氢酶1C(recombinant human alcohol dehydrogenase 1C, ADH1C)、核糖核酸酶(ribonuclease, RNASE)、钾电压门控通道亚家族D成员3(potassium voltage-gated channel subfamily D member 3, KCND3)、钠通道蛋白9型亚基(sodium channel protein type 9 subunit alpha, SCN9A)等靶点能与大于等于10个化合物发生相互作用，证明浙贝母-瓜蒌多成分-多靶点共同作用的特点。

图2 浙贝母-瓜蒌的化合物-疾病-靶点网络

2.3 构建浙贝母-瓜蒌关键靶点的蛋白相互作用网络

STRING数据库基于目前已知和预测的蛋白质之间直接、间接相互作用信息，通过计算得到每个蛋白相互作用程度的P值，P值高则蛋白质相互作用的置信度高。上传浙贝母-瓜蒌与COPD的共同关键靶点至STRING在线数据库，获取蛋白相互作用信息，选取P>0.9的最高置信度的蛋白关系，构建浙贝母-瓜蒌治疗COPD的相关靶点蛋白在系统水平上的PPI网络(图3)。PPI网络包含131个节点和236条相互作用关系(连线)。根据网络拓扑学性质分析结果，其中介数和度值大于均值(介数为0.54，度值为3.6)的关键节点，包括膜联蛋白A1(annexin-A1, ANXA1)、组蛋白脱乙酰基酶1(histone deacetylase 1, HDAC1)、HDAC2、内皮素1(endothelin 1, EDN1)、类视黄醇X受体(retinoid X receptor alpha,RXRA)、Alpha-2肾上腺素能受体(alpha-2A adrenergic receptor, ADRA2A)、催产素(oxytocin, OXT)等，其中RXRA能与12个蛋白发生相互作用。

图3 浙贝母-瓜蒌治疗COPD的相关靶点PPI网络

2.4 GO富集分析

基于DAVID v6.8数据库，采用改进的Fisher精确检验算法对PPI网络中的蛋白进行基因本体GO富集分析，探索浙贝母-瓜蒌的靶点蛋白在基因功能中的作用，应用R软件绘制GO富集分析结果条形图。根据P值(P<0.005)列出前20条GO途径(图4)，分析结果提示浙贝母-瓜蒌相关条目主要涉及离子门控通道活性、门控通道活性、底物特异性通道活性、通道活性、被动跨膜转运活性、离子通道活性、阳离子通道活性、细胞外配体门控离子通道活性、神经递质受体活性、配体门控离子通道活性等。

图4 GO通路富集分析条形图

2.4 KEGG 通路富集分析

应用DAVID v6.8数据库对PPI网络中的蛋白进行KEGG生物通路富集分析，探索浙贝母-瓜蒌活性成分的靶点蛋白在信号通路中的作用，相关靶点基因列表导入DAVID数据库，勾选OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Gene list、Submit list，选择基因功能分类工具，修改背景为人类，选择Pathway，筛选P<0.01的通路确定为可靠通路，结合KEGG数据库进行通路注释和分析。利用R语言对主要代谢通路、生物过程进行绘图分析。KEGG通道分析主要涉及神经活动配体-受体相互作用、cAMP信号通路、钙离子信使通路、类胆碱能突触、逆行内源性大麻素信号传导、5-羟色胺能突触、多巴胺能突触、尼古丁成瘾、催产素信号通路、安非他命成瘾、GABA能突触等途径，通路富集基因ID见表2，根据P值(P<0.05)列出前20条通路(图5)。

图5 KEGG通路富集分析点状图

表2 KEGG通路富集分析靶点基因ID

3 讨论

浙贝母-瓜蒌的关键靶点如ANXA1、HDAC与COPD进展密切相关。ANXA1是一类钙依赖磷脂结合蛋白，与糖皮质激素调节以及作为应激蛋白参与细胞增殖、分化及凋亡等有关，ANXA1在COPD合并肺部细菌感染中高表达，且存在病原菌种类和药物敏差异特点[12]。而HDAC是调节COPD患者炎症因子、氧化应激、糖皮质激素抵抗的主要蛋白之一，参与调控COPD患者的肺泡上皮细胞衰老和慢性炎症进程[13-16]，HDAC2蛋白失活，诱导IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α等炎症因子表达[13]。COPD患者肺组织中HDAC2、HDAC5、HDAC8的mRNA水平显著降低，而重度COPD患者的HDAC2蛋白水平显著降低，HDAC2表达与COPD的气道高反应性具有较高相关度[14]，且与COPD患者肺组织中氧化应激和硝化应激的发生有关[15-16]。因此，HDAC失衡在COPD的炎症进展中非常关键，浙贝母-瓜蒌是否通过恢复HDACs活性，使其发生去乙酰化阻断炎症基因转录、抗氧化应激及减轻糖皮质激素抵抗，从而控制COPD发展值得进一步深入研究。

分析显示浙贝母-瓜蒌的分子途径主要涉及离子门控通道活性、底物特异性通道活性、被动跨膜转运活性、离子通道活性、细胞外配体门控离子通道活性、神经递质受体活性等，推测可能通过影响不同类型通道活性而产生相应药理作用。而KEGG富集分析中相关度最高的途径为神经活动配体-受体相互作用，其中包括类胆碱能、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、多巴胺等神经递质可能在浙贝母-瓜蒌调控COPD中发挥重要作用，即浙贝母-瓜蒌可能通过调控某些通道的活性，影响类胆碱能、5-羟色胺、多巴胺等多种神经活动配体-受体的相互作用而实现多靶点调控COPD的进展，证明了中药复方多成分-多靶点的作用特点。多巴胺是一种中枢神经递质，具有调节神经、内分泌等多种生理功能，还可能存在抗炎作用[17]，研究显示多巴胺受体激动剂可用于治疗COPD的咳嗽和咳痰等症状[18]；在COPD合并心力衰竭治疗中，多巴胺可选择性兴奋心脏β-受体，改善膈肌、脑和冠状动脉供血[19]。COPD患者呼吸道阻塞最重要的可逆机制是胆碱能引起呼吸道收缩，肺部胆碱能神经分布于血管、腺体、支气管平滑肌和呼吸性细支气管。胆碱能受体分为M受体和N受体，肺组织中主要存在M1、M2、M3等3种M受体亚型。COPD患者呼吸道和肺组织中M受体的数量或功能异常，M受体数量减少，M2受体比例降低，M1、M3受体比例增加[20]。5-HT与呼吸系统疾病密切关联，生理状态下5-HT主要储藏于血小板致密体中，当血小板受到炎症、低氧等因素刺激释放大量5-HT并与转运体结合，引起肺血管收缩及血管平滑肌细胞增殖等病理反应[21]，COPD状态下5-HT转运体基因表达明显增高，5-HT大量释放进一步促进COPD加重[22]。此外，KEGG富集分析提示浙贝母-瓜蒌可能同时影响多巴胺和Ca2+信使通路，提示其在COPD心肺功能不全治疗上可能具有一定价值。现代临床治疗COPD心肺功能不全多应用硝苯地平和多巴胺，硝苯地平是一种较强的Ca2+通道阻滞剂，通过抑制Ca2+内流促进扩张冠状动脉和增加血流量、松弛血管平滑肌，降低舒张期细胞内Ca2+超负荷而增强心肌舒缩活动协调性，改善主动脉舒缩功能，降低心率，改善患者气道通气功能[23-25]。因此，浙贝母-瓜蒌是否同时作用于两条通路而改善COPD心肺功能不全仍值得进一步探索。

综上所述，本文基于网络药理学的方法从分子作用机制方面深入挖掘了浙贝母-瓜蒌配伍治疗COPD可能的作用靶点和信号通路，揭示了浙贝母-瓜蒌多成分-多靶点-多通路调控COPD进展的作用特点。我们发现浙贝母-瓜蒌与COPD靶点相关的活性化合物包括较多挥发油类成分及其常含有的小分子醇、醛及酸类化合等，推测浙贝母-瓜蒌的挥发油部分可能是治疗COPD的关键活性部位。COPD存在不同程度的肺气阻塞、通气障碍，根据中医学“滞则通之”的治疗原则可以应用具有芳香行气、理气通关、化湿醒脾等药理作用的芳香类中药，而挥发油成分是芳香中药的主要药理活性部位，浙贝母、瓜蒌虽不属于芳香类药物，但挥发油部位可能具有相似的药理作用。目前关于浙贝母-瓜蒌配伍前后挥发油部位化学成分及药理活性的研究较少，值得深入研究。此外，分子对接及PPI网络提示的关键靶点如ANXA1、HDAC2，其中ANXA1是Campesterol(浙贝母/瓜蒌)、Bryonolic Acid(瓜蒌)、Cucurbitacin C(瓜蒌)3种化合物的共同靶点，而HDAC2是Palmitone(浙贝母/瓜蒌)、N-Nonanol(瓜蒌)、Lauric Aldehyde(瓜蒌)3种化合物的共同靶点，提示该药对协同治疗COPD的作用特点，且以瓜蒌的活性成分为主，这与中药理论中瓜蒌作为君药以“开胸散结”的功效治疗COPD的理念不谋而合，后续可以从两者配伍后关键靶点的表达变化情况及相关活性成分的筛选方面开展进一步研究。生物通路方面主要涉及类胆碱能、5-羟色胺、多巴胺等多种神经活动配体-受体的相互作用等，也为深入研究浙贝母-瓜蒌的整体性作用机制提供参考和新的研究方向。