毛白杨叶际酵母Wapdr15基因的克隆及功能鉴定

郝甜,赵新伟,孙然,才满,杜克久

(1 河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；2 河北林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)

多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)作为常见的环境有机污染物[1-2]，可沿食物链逐级富集至生物体内[3-5]。环境中PBDEs同系物因还原反应脱溴，生成低溴联苯醚[6]，其中4-溴带联苯醚(4-bromodiphenyl ether，BDE-3)作为 PBDEs 脱溴反应的终产物之一[7]，在 PBDEs 生物修复研究中备受关注[8-10]。

ABC 转运蛋白参与生物对逆境的适应过程[11-12]，目前多数研究集中于其对金属或农药抗性等方面[13-15]，并且将酵母 ABC 转运蛋白在植物体内超表达，发现可提高植物对于重金属的抗性[16-17]，而对于其是否参与包括 PBDEs 在内环境持久性有机污染物(POPs)的转运和解毒过程研究尚无报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

毛白杨叶际异常维克汉姆酵母、烟草组培苗由河北农业大学植物修复实验室保存

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因的克隆及序列分析 以异常维克汉姆酵母菌体 DNA 为模板，根据转录组测序结果(未公开)，由上海生工合成如下2条引物分别为正向引物 5′-GGGACTCTTGACCATGTCA

TCAGATATCAGA和反向引物5′-AGTCAGATCTACCATGTCACTTCTTGGGTTTTTC。PCR反应体系(50 μL)包括： 正向引物与反向引物各 1 μL；普通 Taq 酶 Mix：25 μL；DNA：1 μL；ddH2O：22 μL。PCR 扩增反应程序：(1)预变性：94 ℃，2 min。(2)变性：94 ℃，30 s，退火：56 ℃，30 s，延伸：72 ℃，5 min，30个循环。(3)最终延伸，72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳回收扩增片段，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌，菌落 PCR 鉴定阳性菌落，重组质粒送生工生物工程(上海)有限公司测序。

采用 GSDS 在线软件分析基因结构；利用 SMART 进行蛋白质结构域分析，由 DNAMAN 软件与其他物种进行氨基酸序列比对。

1.2.2 植物过表达载体的构建 首先根据对基因全长和载体进行酶切位点分析，选择目的基因内部没有相应酶切位点的酶SalI和SpeI，再将 pCambia1 302-35s、pT-Wapdr15 质粒酶切后，电泳检测，回收目的片段。利用北京全式金生物技术有限公司出品的 T4DNA Ligase 试剂，连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，过夜培养，挑取菌落进行菌落 PCR，阳性克隆提取质粒进行双酶切鉴定目的基因过表达载体是否构建成功。将制备成功的重组载体转化农杆菌，获得携带目的基因的阳性农杆菌菌株。

1.2.3 叶盘法转化烟草及转基因烟草的鉴定 采用叶盘法转化烟草，转化方法参考郭晓蓉[18]。利用 PCR 技术鉴定目的基因是否转入烟草。

同时，对于上市问题，宗庆后此前一直坚持娃哈哈不差钱、不上市。而今年3月，也有媒体报道称，娃哈哈开始为上市而瘦身——清退员工股份。宗庆后也改口表示，未来如果有大的产业要投资，娃哈哈也要上市募集资金。

1.2.4Wapdr15基因功能初步分析 从生长一致的未转基因和转入Wapdr15基因的烟草组培苗相同部位，剪取叶片，平铺到烟草分化培养基上，并吸取 10 μL 5 mg/mL BDE-3 滴到不同烟草叶片上，观察记录不同烟草叶片的受害情况。

2 结果与分析

2.1 目的片段的克隆

目的基因克隆结果见图1。

以酵母 DNA 为模板，PCR 扩增产物电泳检测结果如图1 a所示。引物设计时预计Wapdr15基因 PCR 扩增产物的片段长度为 4 536 bp，由图1 a可知，各基因的 PCR 产物片段大小与预计片段长度一致。回收纯化的目的基因 DNA 片段与 pUCm-T 载体进行连接，菌落 PCR 检测电泳结果如图1 b所示。由图1 b 可知，泳道 1-4 号出现目的条带，与泳道 5 阳性对照中条带位置相同，而阴性对对照(泳道 6)中则无条带。提取阳性转化菌质粒送往生工(上海)生物有限公司测序。

Wapdr15测序结果及编码氨基酸序列见图2。

如图2所示，经 NCBI 序列比对，与异常维克汉姆酵母目的基因的相似度为 98%，说明目的基因Wapdr15克隆成功，将序列正确的质粒命名为pT-Wapdr15。毛白杨叶际异常维克汉姆酵母(W.anomalus)Wapdr15基因长度为4 536 bp，编码1 511个氨基酸。

2.2 Wapdr15基因生物信息学分析

Wapdr15基因结构分析结果如图3所示。

由图 3 可知，Wapdr15基因中无内含子结构。

Wapdr15基因编码氨基酸序列结构域分析结果如图4所示。

图4 WaPDR15蛋白质结构域Figure 4 Domain structure of WaPDR15 protein

由图 4 可知 WaPDR 15转运蛋白含有 ABC 蛋白的结构域PDR-CDR(710～802)，符合 ABC 转运蛋白 G 家族的结构特点，所以WaPDR 15转运蛋白属于 ABCG 家族。WaPDR15 共包含 2 个 NBD (173～383，870～1 061)和 TMD (489～699，1 158～1 378)，形成了 NBD1～TMD1～NBD2～TMD2结构，为典型的全分子蛋白。

WaPDR15 与其他物种 ABC 转运蛋白氨基酸序列比对结果如图5所示。

图5 WaPDR15与其他物种氨基酸比对Figure 5 The amino acids of WaPDR15 comparison with other species

由图 5 可知 WaPDR15 N 端的 NBD 结构域中包含 ABC 转运蛋白序列中高度保守的 Walker-A、Walker-B 基序。

2.3 植物过表达载体的构建

pT-Wapdr15、pCam1 302-35s 质粒酶切结果见图6。

由图6 a中可知，1～3泳道中片段长度为5 000 bp，与目的基因长度相符。由图6 b中可知，1～5泳道片段长度为11 000 bp，与待连接质粒长度相符。

图6 质粒酶切电泳检测结果Figure 6 Detection results of plasmid enzyme cutting electrophoresis

重组质粒菌落PCR及酶切电泳检测结果见图 7。

图7 重组质粒菌落PCR及酶切电泳检测结果Figure 7 Detection results of recombinant plasmid colony PCR and enzyme digestion electrophoresis

由图 7a可知，酶切回收产物与表达载体 pCam1 302～35 s连接，菌落PCR鉴定结果中泳道1、2号出现目的条带，与泳道3阳性对照中条带位置相同，而阴性对照中则无条带，表明pCam-Wapdr15初步构建成功。为进一步确保载体构建正确，挑选目的条带明亮的 2 号菌落，提取质粒，进行质粒 PCR 和酶切鉴定。由图7 b可知，酶切产物电泳检测出现两条带，大片段11 000 bp和小片段5 000 bp，结果与预期相符，经鉴定获得植物表达载体pCam-Wapdr15重组质粒。

农杆菌菌落PCR结果如图8所示。

图8 农杆菌菌落PCR凝胶电泳图Figure 8 PCR gel release results of agrobacterium colonies

采用热激法将pCam-Wapdr15转入Agl 1农杆菌，菌落PCR鉴定结果如图8，所扩增的片段与阳性对照一致，说明基因成功转入 Agl 1 农杆菌中。

2.4 叶盘法转化烟草及转基因烟草的鉴定

转化烟草过程如图9所示。

图9 Wapdr15基因转化烟草Figure 9 Tobacco transformed with the Wapdr15 gene

由图9可知，将含有目的基因pCam-Wapdr15的农杆菌转入烟草，培养1个月后，进行筛选生根，得到疑似含 pCam-Wapdr15基因的抗性植株。选取生长状况良好的烟草组培苗叶片(图9a)，剪成1 cm2方块，培养基中加入抗生素后筛选转染成功的烟草叶片(图9b)，叶片上开始出现不定芽(图9c)，1个月后逐渐长出不定根(图9d)。

转基因烟草组培苗验证结果如图10所示。

图10 转基因植物的PCR扩增1%琼脂糖凝胶电泳图Figure 101% agarose gel electrophoresis of PCR product of transgenic plants

由图10可知，以转基因植株的 DNA 为模板，以含有目的基因片段pCam-Wapdr15的质粒为阳性对照，以野生型烟草植株作阴性对照，对 5 个烟草株系进行 PCR 扩增鉴定。转基因烟草株系和阳性对照扩增结果一致，且阴性对照植株没有扩增出特异性条带，说明成功获得了Wapdr15的转基因植株，可用于后续试验。

2.5 WaPDR 15转运蛋白基因的功能分析

转基因烟草和野生烟草对 BDE-3的耐受情况如图11所示。

图11 转基因烟草对BDE-3的耐受情况Figure 11 Tolerance of transgenic tobacco to BDE-3

如图11所示，为探究Wapdr15转基因烟草植物对 BDE-3 耐受情况，分别在叶龄一致的烟草叶片下表面的固定位置滴加10 μL 5 mg/mL的BDE-3，每24 h观察叶片滴加部位的坏死情况。野生型对照组烟草叶片在滴加BDE-3第4天出现褐化坏死斑(图11白色箭头所指)，而转毛白杨叶际异常维克汉姆Wapdr15转基因的烟草叶片未出现褐化坏死斑，表现出一定抗性。

3 讨论与结论

ABC 转运蛋白参与生物抗逆过程，真菌中 ABC 转运蛋白在植物中的超表达可以提到转基因植物的抗性；酿酒酵母 YCF1 可以明显提高印度芥菜(Brassicajuncea)对Cd和Pb的耐性；粟酒裂殖酵母中的ABC转运蛋白Sp HMT1可以提高拟南芥种子的Cd耐性[16-17]。

Wapdr15基因编码蛋白质中包含保守度极高的 Walker-A、Walker-B 基序[12]，与葡萄中 ABCG 亚族中蛋白结构相似[19]，这些结构和保守基序都有助于NBD 与 ATP 结合并水解[20]，为物质的跨膜运输提供能量，提高生物抗逆能力。Wolfge 等[21]的研究结果显示，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) ABCG 转运蛋白pdr15由转录因子pdr1和pdr3控制，pdr1和pdr3通过与顺式作用位点 PDREs(PDR响应元件)结合，调控 ABC转运蛋白药物外排泵的表达，从而产生抗药性。为研究Wapdr15基因对 BDE-3 的作用，对Wapdr15基因进行克隆、构建Wapdr15基因过表达载体并转化烟草，分析转入Wapdr15基因烟草对 BDE-3 的耐受情况，发现转基因的烟草对 BDE-3 的耐受显著好于野生型对照烟草，毛白杨叶际异常维克汉姆 WaPDR15 ABC转运蛋白可以增强烟草对于PBDEs的耐受性。

综上所述，Wapdr15基因编码序列长4 536 bp，为全分子跨膜蛋白。毛白杨异常维克汉姆 WaPDR15ABC 转运蛋白对 BDE-3 有解毒作用。这些发现都将有助于进一步揭示毛白杨叶际异常维克汉姆酵母对 BDE-3 耐受解毒分子机制，并可以为包括林木在内的植物对有机污染物修复机制研究提供借鉴。毛白杨叶际异常维克汉姆酵母 ABC 转运蛋白基因Wapdr15有望成为包括毛白杨在内的杨树以及其他木本植物遗传转化的抗有机污染物基因资源，为获得可修复 BDE-3及其他 PBDEs 以及 POPs 的木本植物新种质奠定理论基础。