Kininogen 1在非小细胞肺癌体液和组织中的表达及临床意义

王巍伟 王珊珊 张 曼

(1. 首都医科大学附属北京世纪坛医院呼吸与危重症医学科， 北京 100038； 2. 首都医科大学附属北京世纪坛医院临床检验中心,北京 100038； 3. 尿液细胞分子诊断北京市重点实验室， 北京 100038)

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，占所有癌症死亡人数的1/4以上[1]。而大约85%的肺癌患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，NSCLC是肺癌的主要病理类型,NSCLC又包括肺腺癌、肺鳞癌、肺大细胞癌。尽管肺癌的诊疗技术不断进步，但是非小细胞肺癌患者的5年生存率仍在15%左右[1]。这主要是由于肺癌的生物学特性十分复杂，被确诊时多已进入晚期，而且目前缺乏治疗肿瘤转移的有效手段[2]。因此，迫切需要早期检测肺癌以降低病死率。因此，如何简单、无创、有效地筛查NSCLC并预测患者的生存情况一直是临床工作关注的重点之一。肿瘤标志物是指由肿瘤组织或宿主与肿瘤相互作用所产生的一类活性物质，能够提示肿瘤存在与生长变化。肺癌的标志物可存在于血浆、肺泡灌洗液、尿液或组织中。肿瘤标志物检测具有操作便捷、标本易获取、易于动态监测疾病等优点，是肺癌的重要辅助诊断手段[3-5]。激肽原1(kininogen 1，KNG1)是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗血管生成并介导抑制内皮细胞增生的特性[6]。最近，研究[7]显示KNG1可作为结直肠腺瘤和结肠直肠癌的血清生物标志物。唾液中的KNG1可用于辅助诊断口腔鳞状细胞癌及监测筛查口腔癌的高危人群[8]。然而，目前关于KNG1在NSCLC患者的研究很少。本研究目的是通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)评估不同体液中的KNG1的浓度是否可能是潜在的NSCLC标志物，通过免疫组织化学法检测NSCLC组织中的KNG1的表达情况，了解其在NSCLC患者中的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年10月至2017年3月，在首都医科大学附属北京世纪坛医院病理确诊的NSCLC患者40例作为病例组，其中男性26例、女性14例，年龄34～82岁,平均年龄(64.2±9.0)岁。非肺癌的呼吸系统异常患者20例作为对照组。所有NSCLC患者均有病理诊断，并根据2009年国际抗癌联盟和美国癌症联合委员会[9]颁布的标准进行TNM分期。其中肺癌患者的病理类型：肺腺癌20 例，肺鳞癌20 例；临床分期：早期肺癌(Ⅰ、Ⅱ期)16例，中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)24例，合并胸膜转移患者5例，无胸膜转移34例，合并淋巴结转移患者31例，无淋巴结转移9例。良性的呼吸道异常疾病包括慢性咳嗽、支气管炎、咯血、结节病、肺结核、支气管扩张及良性的肺结节。纳入标准：①年龄18～85岁；②病理确诊为NSCLC。排除标准：①合并其他部位肿瘤者;②收集标本前已进行手术、放谢治疗、化学药物治疗、免疫治疗者;③进行肾功能和尿沉渣检查，尿样本显示肉眼、镜下血尿，尿微量白蛋白/肌酐比(Alb/Cr)<30 mg/g。另外，还留取了40例NSCLC手术患者的癌组织及癌旁对照组织。其中腺癌标本20例，鳞癌标本20例。癌旁正常组织距离肿瘤至少5 cm。本研究方案经首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会批准,伦理学审批号:2014-5。

1.2 体液标本采集

所有入选者空腹，抽取静脉血4 mL并EDTA抗凝，4 ℃，3 600 g离心10 min后，取上层血浆，-80 ℃保存待测。

收集NSCLC患者和对照组的清晨中段尿约50 mL，400 g条件下离心15 min去除细胞碎片等，保留上清，分装后储存在-80 ℃冰箱。

用2%(体积分数)利多卡因实现局部麻醉。采用奥林巴斯BF 240型支气管镜行气管镜检查采样。在刷片或活组织检查之前进行灌洗以避免血液污染。将支气管镜末端紧密嵌入病变所在的段或亚段支气管开口处，经支气管镜活检孔分5次注入37 ℃ 0.9%(质量分数)氯化钠注射液(以下简称生理盐水)100 mL 至肺段或肺亚段，每次注入后立即在50～100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)负压吸引回收液，回收的40 mL以上的肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)被认为是可接受的质量水平。然后立即将BALF 1 500 g离心10 min，得到的无细胞成分的上清液后在-80 ℃冷冻保存。

1.3 体液标本检测

1.3.1 ELISA检测KNG1在血浆、BALF和尿液中的浓度

血浆、BALF和尿液中的KNG1浓度检测使用市售ELISA试剂盒(KNG1, 美国Abnova公司)，按照生产商说明书的要求和步骤进行检测。血浆和BALF 样本分别稀释200倍、100倍。然后把血浆、BALF和尿液的样本在KNG1 ELISA板中孵育,使用680型酶标仪(美国BIORAD公司)在450 nm处测量吸光度。使用标准样品的浓度和每个孔的相应吸光度值绘制每个平板的标准曲线。试验中使用了阳性对照和阴性对照。

1.3.2 免疫组织化学法检测

术中获得的NSCLC和癌旁正常组织经10%(质量分数)甲醛固定，石蜡包埋，切成 4 mm切片。二甲苯中脱蜡20 min，在100%、100%、95% 和75%(体积分数)乙醇中脱水，各2 min。在磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline, PBS)中漂洗5次10 min后，高压修复抗原。然后用PBS液洗涤玻片10 min，在3%(体积分数)H2O2中孵育15 min，再次PBS冲洗10 min。抗原修复后，样本与的KNG1抗体(1∶200)在4 ℃孵育过夜。然后用 PBS 洗涤样本，用辣根过氧化物酶偶联的二抗(北京中山金桥生物技术公司)在 37 ℃孵育20 min，PBS洗涤15 min。3,3′-二氨基联苯胺溶液(北京中山金桥生物技术公司)染色5 min，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯清洗，天然树胶密封。免疫组织化学法均设阳性及阴性对照。

每张切片随机选取10个高倍视野(1 000×)，根据染色强度和面积对每个样品进行评分。染色强度评分：0为无染色;1为轻度染色; 2为中度染色和3为强烈染色。 阳性细胞百分比分为五类：0为无染色;1为1%～10%; 2为11%～50%; 3为51%～80%; 4为81%～100%。 将染色强度和百分比相乘以产生总分。总分4～12被定义为阳性表达，0～3被认为是阴性表达[9]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 基本情况

病例组与对照组患者基本特征见表1，组间年龄、性别、吸烟史差异无统计学意义。

表1 两组基本特征比较Tab.1 Demographics of two groups n(%)]

病理类型：肺腺癌20例，肺鳞癌20例；临床分期：早期肺癌(Ⅰ、Ⅱ期)17例，中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)23例。40例患者均无胸膜转移，合并淋巴结转移患者30例，无淋巴结转移10例。不吸烟患者20例，有吸烟史患者20例。

2.2 KNG1在NSCLC和对照组的血浆、BALF和尿液中浓度

NSCLC患者血浆、BALF和尿液中的KNG1浓度均高于对照组(P<0.001),详见表2。腺癌和鳞癌患者中的KNG1浓度在血浆、BALF和尿液中比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表3。NSCLCⅠ+Ⅱ期患者与Ⅲ+Ⅳ期患者的KNG1浓度在血浆、肺泡灌洗液和尿液中比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4。

表2 两组患者的血浆、BALF和尿液中KNG1浓度Tab.2 Plasma, BALF and urine concentrations of KNG1 of two groups

表3 肺腺癌和肺鳞癌患者的血浆、BALF和尿液中KNG1浓度Tab.3 Plasma, BALF and urine concentrations of KNG1 in LUAD patients and LUSC patients

表4 不同分期非小细胞肺癌患者的血浆、BALF和尿液中KNG1浓度Tab.4 Plasma, BALF and urine concentrations of KNG1 in NSCLC patients with different stage

2.3 KNG1对NSCLC的诊断价值

各标本中KNG1的ROC曲线下面积均>50%(P<0.05)。根据Youden指数诊断NSCLC的最佳预测临界值血浆为1 653.6 mg/L，BALF为52.1 mg/L，尿液为2.3 mg/mL，以此诊断的结果显示，尿液的一致性最高(Kappa=0.59)，尿液诊断效果优于血浆和BALF，详见表5。

表5 KNG1在血浆、BALF和尿液中的诊断参数Tab.5 Diagnostic parameters of KNG1 in plasma, BALF and urine

2.4 KNG1在NSCLC、癌旁正常组织中的表达

免疫组织化学法检测结果显示KNG1蛋白主要在细胞质中表达(图1)。 在40例NSCLC患者肿瘤组织中,其中有19例出现KNG1的表达，阳性表达率为47.5%；而在相对应的40例NSCLC患者癌旁正常组织中，KNG1的阳性表达率仅为10% (4/40)，二者阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.001，表6)。鳞癌和腺癌组织中KNG1的阳性表达率分别为45%(9/20)、50%(10/20)，差异无统计学意义(P=1.000)。

图1 免疫组织化学法检测KNG1在非小细胞肺癌及癌旁正常组织中的表达Fig.1 Expression of KNG1 in NSCLC tissues and adjacent normal lung tissues immunohistochemistry(1 000×)A: lung adenocarcinoma cell； B: adjacent normal lung tissues； C: lung squamous cell carcinoma； D: adjacent normal lung tissues. KNG1： kininogen 1； NSCLC： non-small cell lung cancer; bronchoalveolar lavage fluid.

表6 KNG1在非小细胞肺癌及癌旁正常组织中的表达Tab.6 Expressions of KNG1 in NSCLCs and adjacent normal lung tissues

3 讨论

肺癌患者生活质量和生存率的提高，主要依赖于肺癌的及时诊断治疗，甚至是对高危人群的简单、无创、容易接受的筛查手段。肿瘤标志物在肺癌的早期诊断及治疗的预后判断方面有着重要作用。肿瘤标志物主要存在于肿瘤细胞或宿主体液中。鉴定体液中的生物标志物对肺癌检测非常有意义。由于对血液蛋白质组的丰富认识，血液是发现生物标志物的最常用标本。而BALF与肺组织相互作用密切，可直接反映肺的状态，在一定程度上与肺活检具有一定的等效性[4]。尿液可通过无创的手段采集，可反复获得足够的样本数量，用于生物标志物检测更能令患者接受[3]。此外，由于尿中蛋白水解降解水平较低，尿蛋白更趋向于稳定，是非常有前景的肺癌标志物标本。

在本研究探讨KNG1在血浆、BALF和尿液以及NSCLC肿瘤组织中的表达情况。KNG1在NSCLC的血浆、BALF及尿液中较对照组升高，且KNG1的浓度在血浆中显著高于在BALF中，BALF中KNG1浓度显著高于在尿液中的浓度。KNG1在血浆、BALF和尿液中的表达水平均和肿瘤的分期相关。腺癌和鳞癌的水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。且KNG1在尿中的ROC曲线下面积为0.81，在BALF中的AUC值为0.89，进一步说明BALF中的KNG1可能是潜在的NSCLC生物标志物。

KNG1由KNG1基因编码，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可被切割成6个亚链，在血液凝固中发挥重要作用。越来越多的证据[6，10-15]证明KNG1在致癌中的作用，它在不同的肿瘤中表达水平不同。在乳腺癌[11]、宫颈癌[6]、子宫内膜癌[6]、卵巢癌[12]、肾细胞癌[13]患者的尿液中，KNG1的浓度较低。此外，KNG1在胶质瘤细胞[14]和肾细胞癌组织[11]中低表达。相反，其他研究表明肝细胞癌[16]、胃癌[17]和结直肠癌[7]患者血浆中 KNG1浓度升高。免疫组织化学法检测结果显示，结直肠癌和进展期大肠腺瘤组织中KNG1的表达明显高于正常黏膜[18]。生物信息学分析显示，KNG1可能在结直肠癌肝转移过程中发挥重要作用[19]。另外KNG1在其他体液中，如口腔鳞状细胞癌患者的唾液[8]和胆管癌和胰腺癌的胆汁也升高[20]。在本研究中，与对照组相比，NSCLC患者的血浆、BALF和尿KNG1水平均显著升高。40例手术切除的NSCLC和癌旁正常组织的免疫组织化学结果显示，与非肿瘤组织相比，KNG1在肿瘤细胞中的表达显著增高，可能NSCLC患者的血浆、BALF 和尿液中 KNG1的表达上调来自于癌细胞产生的增多。尽管KNG1在癌症中的作用机制还不清楚，但KNG1能抑制内皮细胞的增生、迁移，抑制新生血管形成，其在癌症患者中的表达下调可能与癌细胞的存活相关[6]。研究[14]显示，异常的ceRNA介导的KNG1调控，有助于胶质母细胞瘤诱导的血管生成，这为胶质母细胞瘤的新治疗策略的发展提供了潜在的靶点。另一项研究[21]显示，KNG1是引起肝癌治疗中非常重要的靶向药物索拉非尼耐药的核心基因。所以KNG1不仅和肿瘤的发生、发展、预后有关，还可能和肿瘤的治疗和耐药相关，需要进一步的研究。

KNG1蛋白是在NSCLC与正常组织中的差异表达蛋白，KNG1基因表达水平和NSCLC患者的预后相关，对NSCLC的发生、发展、侵袭和转移可能起着重要的促进作用。而在体液，特别是尿液中测定KNG1是一种简单、无创并且可大量、反复获取标本的方法，所以，血浆、BALF，尤其是尿液中的KNG1有望成为NSCLC的潜在肿瘤标志物，在NSCLC的辅助诊断和高危人群的筛查甚至预后判断方面可能起到很好的作用。