榼藤对牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎大鼠的治疗作用研究

许锦虹，罗苗，姜海琴，熊慧，梅之南，杨光忠*

(1 中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 劲牌有限公司，武汉 430000)

豆科榼藤属植物榼藤Entadaphaseoloides在傣族和壮族等民族中有着广泛的应用历史.榼藤子入药，味涩、甘，归肝、肾、大肠经，主治胃痛、黄疸、痔疮、便秘等病症，为《中国药典》2015年版收录“七味榼藤子丸”的主药[1-2].壮医主要以藤茎入药，又名过岗龙，用于治疗弊病、跌打损伤等[3].榼藤属提取物中主要含有榼藤酰胺类、酚及酚苷类、三萜皂苷类成分，尚含有少量的倍半萜、黄酮、甾体、生物碱及多糖类成分[4-5].研究采用牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎(Collagen-induced Arthritis，CIA)模型大鼠[6]，以榼藤藤茎提取物给药干预，来初步探究榼藤提取物的抗炎药理作用以及相关分子机制，以期为榼藤抗类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)药效及机制研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

Wistar大鼠50只，雄性，SPF级，体质量150～170 g，购于湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018，适应性喂养5 d，自由进食饮水.

榼藤藤茎采自云南西双版纳，经中南民族大学药学院刘新桥副教授鉴定为豆科榼藤属植物榼藤Entadaphaseoloides的藤茎，标本存放于中南民族大学民族药物研究院.

取榼藤藤茎8.0 kg，粉碎，用70%乙醇水提取3次，每次24 h，提取液减压浓缩，得浸膏518 g，干燥得提取物[7].

1.2 试剂和仪器

雷公藤多苷片(贵州汉方药业)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药)；牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex)；弗氏完全/不完全佐剂(美国Sigma)；ELISA试剂盒(武汉华联科)；异戊巴比妥钠(美国Merck)；胎牛血清(美国Gibco)；DEME培养基(美国HyClone)；脂多糖(LPS,美国Sigma)；DEPC水(Biosharp Life sciences)；氯仿、异丙醇、无水乙醇(国药集团)；RNAiso Plus(Takara)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Select Master Mix(美国赛默飞).

全波长酶标仪(1510，美国赛默飞)；医用离心机(3-18KS，美国Sigma)；CFX ConnetTMReal-Time system(美国Bio-Rad)；C1000TouchTMThermal cycler(美国Bio-Rad).

1.3 造模、分组及给药

在相同标准的饲养环境下每只Wistar大鼠尾根部皮内注射牛Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂的乳化剂0.1 mL(1.0 mg/mL)进行初次免疫，10 d 后再次注射相同剂量进行二次免疫.两次免疫实验同时另取6只Wistar大鼠尾根部注射等体积的生理盐水.14 d后筛选出现继发侧关节炎的Wistar大鼠36只，随机分为6组，每组6只，即模型组(CIA)，雷公藤多苷片组(TPT，20.00 mg/kg)，地塞米松组(DEX，0.25 mg/kg)，榼藤提取物低、中、高剂量组(EP，93.75、187.50、375.00 mg/kg).初次造模时间为0 d(0 D)，雷公藤多苷片组(20.00 mg/kg)，地塞米松组(0.25 mg/kg)，榼藤提取物低、中、高剂量组(EP，93.75、187.50、375.00 mg/kg)，在第15 d(D 15)开始每天上午灌胃给药，空白组和模型组灌胃等容体积的生理盐水.地塞米松组每4 d给药一次，其余组每天一次，连续灌胃给药35 d.其中地塞米松片、雷公藤多苷片、榼藤提取物均用生理盐水溶解，每只大鼠给药容积为10.0 g/0.1 mL.

1.4 足趾肿胀度测定

在第10 d二次免疫前测量大鼠右后足脚趾容积，之后每4 d一次.于大鼠右后足踝关节处用红色马克笔划线标记，用左手握住大鼠的前肢下，右手捉住大鼠后膝关节处使其后脚伸直固定，缓慢放入测量杯内，当水平面与鼠足上的测量标线重叠时，踏动脚踏开关，读取数据，并计算肿胀度.测量部位尽量少移动，每次测量的部位一致.由专人负责，测量动作要熟练，尽量减少误差.

肿胀度(mL)=造模后足爪容积-造模前足爪容积[8].

1.5 RA模型相关指标的检测

1.5.1 动物取材

分别取大鼠的脾脏、腹主动脉血及踝关节待测[9].

1.5.2 组织切片及染色

取大鼠踝关节于10 %中性甲醛溶液中固定，96 h后换脱钙液，等到用大头针刺关节时无阻力或者阻力很小时，即脱钙完成，关节脱钙完成后梯度脱水，浸蜡，包埋.待石蜡冷却后从模具中取出蜡块放置于-20 ℃冰箱中过夜，次日开始切片(4.0 μm).切片后通过HE染色从滑膜细胞侵蚀，血管翳增生，炎细胞浸润，软骨损伤等方面在显微镜下(100 ×)观察踝关节的病理改变[10].

1.5.3 脾脏指数测定

取材前称量大鼠体重(g)，取材后记录大鼠脾脏重量(mg).

计算脾脏指数，脾脏指数(mg/g)=(脾脏重量/大鼠体重)×10

1.5.4 大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2含量测定

腹主动脉取血，4000 r/min离心10 min，取上清.按照ELISA试剂盒中的操作步骤来检测血清中IL-1β、IL-17、PGE2的含量.

1.6 体外细胞实验

1.6.1 细胞培养

细胞株小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国典型培养物保藏中心；加入含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM培养液，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长至80%～90%融合后进行传代培养，实验时取对数生长期细胞.

1.6.2 MTT法检测细胞增殖

根据文献[11]，取对数生长期的巨噬细胞，经胰酶消化后加入完全培养基，在显微镜下观察细胞状态良好，调整细胞浓度至2×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔加入200 μL细胞悬液，置于培养箱中培养24 h.吸取培养液，分组加入药液.空白组设8个复孔,每孔加入200 μL完全培养基;供试组设置7个不同浓度：6.25 、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、200.0 μg/mL，每个浓度设置8个复孔，每孔加200 μL供试品溶液.阳性药组为10 μM地塞米松，设置8个复孔每孔200 μL.另外设置4个调零孔，不加细胞.加药后在培养箱中继续培养24 h，于实验结束前4 h吸去溶液，用PBS洗2～3次，再用DMEM完全培养基配置MTT(5.0 mg/mL)，每孔加100 μL，孵育4 h，吸尽上清，加入100 μL DMSO，振荡10 min，至沉淀完全溶解后用自动酶标仪在波长490 nm处读取吸光值.

细胞增殖抑制率计算：

1.6.3 荧光定量PCR

取对数生长期细胞，细胞浓度为2×105个/mL，接种于12孔板中，每孔加入1 mL细胞悬液，置于培养箱中培养24 h.吸取上清液，分组加入药液，每组设置两个复孔.空白组(NC)每孔加1 mL DMEM培养基，模型组为LPS(1.0 μg/mL)；EP 12.5 μg/mL，同时含1.0 μg/mL LPS；EP 25.0 μg/mL，同时含1.0 μg/mL LPS；EP 50.0 μg/mL，同时含1.0 μg/mL LPS；DEX 10.0 μmol/L，同时含1.0 μg/mL LPS.所有给药的溶液都用DMEM配置，每孔都加1.0 mL供试液.3 h后，吸取培养基，用预冷的PBS漂洗1～2次后向每孔加入1 mL RNAiso Plus，在提取细胞样本中的RNA后反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应.所用PCR引物序列见表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7 统计学处理方法

Graph Pad Prism 6软件用于数据统计分析和图形处理，所有数据均表示为 -x±s，P<0.05被认为具有统计学意义.

2 结果和分析

2.1 榼藤提取物对CIA大鼠足趾肿胀度的影响

与空白组相比，模型组大鼠足趾肿胀程度存在明显的差异(图1)；与模型组比较，各给药组从第18 d开始足趾肿胀度逐渐降低.其中地塞米松组足趾肿胀度下降最明显，榼藤提取物组也明显降低了大鼠的足趾肿胀度，并呈现剂量依赖性.图中空白组与模型组相比：dP<0.001，模型组与各个给药组相比：aP<0.001，bP<0.01，cP<0.05.

图1 榼藤提取物对CIA大鼠足趾肿胀度的影响Fig.1 The effect of Entada phaseoloides extract on toe swelling of CIA rats

2.2 榼藤提取物对CIA大鼠踝关节组织病理学的影响

如图2所示，黑色箭头代表关节软骨，黄色或绿色箭头代表轻微或严重的结缔组织增生.空白组大鼠关节滑膜组织为1～2层细胞，排列整齐，未见炎症细胞浸润；模型组大鼠滑膜组织中可见关节滑膜出现增生，关节腔内观察不到关节软骨，关节软骨消失，骨关节内骨髓细胞增生，骨小梁等结构减少，骨结构被破坏；与模型组相比雷公藤多苷片组、地塞米松组和榼藤提取物各剂量组中滑膜组织增生程度较低，炎性细胞浸润减轻，血管翳较少.

图2 榼藤提取物对CIA大鼠踝关节组织病理学的影响Fig.2 The effect of Entada phaseoloides extract on histopathology of ankle joint in CIA rats(a)正常组；(b)模型组；(c)雷公藤多苷片组；(d)地塞米松组；(e)榼藤提取物低剂量组；(f)榼藤提取物中剂量组；(g)榼藤提取物高剂量组

2.3 榼藤提取物对CIA大鼠脾脏指数的影响

结果如图3所示，空白组与模型组相比脾脏指数存在显著性的差异.与模型组相比，各给药组的脾脏指数均有所降低.图中模型组与空白组相比###P<0.001，各个给药组与模型组相比***P<0.001，**P<0.01.

图3 榼藤提取物对CIA大鼠脾脏指数的影响Fig.3 The effect of Entada phaseoloides extract on spleen index of CIA rats

2.4 榼藤提取物对CIA大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2含量的影响

与空白组比较，模型组和各给药组大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2含量增加(图4)；与模型组比较，各给药组大鼠血清中IL-1β、IL-17、PGE2的含量均有不同程度的降低，其中榼藤提取物高剂量组、地塞米松组和雷公藤多苷片组降低程度显著，榼藤提取物高剂量组对抑制这些炎性因子呈现出相似的效果.榼藤提取物的低、中、高剂量组呈现出剂量依赖性.图中模型组与空白组相比###p< 0.001，各个给药组与模型组相比***p< 0.001 ，**p< 0.01 ，*p< 0.05.

2.5 MTT法检测榼藤提取物对巨噬细胞RAW264.7体外增殖的影响

如图5所示，MTT结果显示榼藤提取物的给药浓度在100.00 μg/mL 以内对细胞的生长无明显的抑制作用，即无细胞毒性，因此在此实验的基础上进行体外细胞实验浓度梯度的选择具有可靠性.图中与空白组相比***P< 0.001.

图5 榼藤提取物对巨噬细胞RAW264.7体外增殖的影响Fig.5 The effect of Entada phaseoloides extract on the proliferation of macrophages RAW264.7 in vitro

2.6 榼藤提取物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7中IL-1β、TNF-α、PGE2基因表达的影响

如图6所示，在LPS诱导的体外细胞炎症模型中，与空白组相比，模型组的中促炎因子IL-1β、TNF-α、PGE2的表达明显上调；与模型组相比，各给药组对IL-1β、TNF-α、PGE2均有不同程度的降低.其中不同浓度的榼藤提取物组对IL-1β的下调明显并且呈现出剂量依赖性；同时榼藤提取物对TNF-α的下调明显，但是高剂量组与模型组相比不存在显著性差异；榼藤提取物能明显降低PGE2的表达，但是阳性药组对PGE2的表达没有影响.图中模型组与空白组相比###P<0.001，##P<0.01 ，各个给药组与模型组相比***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.

图6 榼藤提取物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7中相关炎性因子表达的影响Fig.6 The effect of Entada phaseoloides extract on the expression of related inflammatory factors in LPS-induced macrophage RAW264.7

3 讨论

本研究建立了类风湿性关节炎(CIA)大鼠模型，实验结果表明榼藤提取物对CIA大鼠有明显的治疗作用，榼藤提取物各剂量组CIA大鼠的足趾肿胀度在给药后明显低于模型组，说明榼藤提取物能有效改善CIA大鼠的踝关节肿胀度,具有明显的抗炎、消肿作用.通过HE切片染色，从形态学的角度能直观地看到榼藤提取物组以及两组阳性药均能抑制滑膜组织增生，降低炎性细胞浸润，减少血管翳生成，能较好地改善CIA大鼠踝关节组织病理状态.

脾脏的免疫功能在机体的淋巴器官中占有重要的地位，CIA大鼠因免疫功能增强，脾脏指数有不同程度的升高，而相对于模型组而言，榼藤提取物可以减轻CIA大鼠脾脏的水肿程度，降低CIA大鼠的脾脏指数，说明其能减轻CIA大鼠脾脏的炎症程度.

IL-17、IL-1β都参与了RA的多个发病环节，其中IL-17能够促进滑膜细胞分泌多种细胞因子，并能诱导活化Th17细胞，促进Th17细胞增殖；IL-17也可促进补体C3等急性期反应蛋白的产生，诱导炎症反应，并协同其他致炎因子，导致RA的进一步发展[14]，而PGE2可舒张小血管，增加微循环通透性，增加渗出与水肿，诱导白细胞聚集，加重关节炎症反应；榼藤提取物各剂量组CIA大鼠血清中的IL-1β、IL-17、PGE2的含量明显低于模型组，说明榼藤提取物可能是通过下调IL-1β、IL-17、PGE2等相关炎性因子从而达到治疗类风湿关节炎的炎症反应[15].

巨噬细胞是机体炎症反应的重要参与者，LPS是巨噬细胞重要的激活因子，可以直接诱导巨噬细胞释放促炎因子[16].TNF-α是炎症反应过程中的初级内源性炎症因子,IL-1β、PGE2也是促炎因子，共同参与炎症相关的疾病.本实验结果显示，经LPS诱导的小鼠巨噬细胞TNF-α、IL-1β、PGE2分泌量上升，与空白组存在明显的差异，说明构建的巨噬细胞炎症模型成功.与模型组相比，榼藤提取物各剂量组都能明显下调相关炎性因子的表达，说明榼藤提取物在细胞水平上可能是通过抑制TNF-α、IL-1β、PGE2等炎性因子的表达从而改善炎症症状.综上所述，榼藤提取物能有效改善CIA大鼠的炎症症状，其作用可能与抑制炎性因子IL-17、IL-1β、TNF-α及PGE2的合成或释放、抑制免疫功能等有关，其抗炎作用具体机制及具体抗炎组分有待于进一步的研究.