酱香型白酒中氨基甲酸乙酯的快速检测及风险评估

彭小东，李红洲，谈晓君，肖超，张建

1. 贵州省产品质量检验检测院（贵阳 550014）；2. 国家酒类及加工食品质量监督检验中心（贵阳 550014）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC），又称尿烷，自然存在于发酵食品和饮料酒中，主要是在其发酵过程和存储过程中产生[1-2]。早有研究表明，EC对动物具有致癌作用，可导致动物出现肺癌、淋巴癌和皮肤癌等疾病，其中对猴子的致癌作用表明EC对人类也可能存在致癌的风险[3-5]。2007年，国际癌症研究机构将EC归为2A类致癌物。许多国家在饮料酒中已有对EC最大允许限量进行相关规定，虽然各国并不一致，但对蒸馏酒中EC的最大限量主要参考了加拿大的标准，为150 μg/L[6-7]。目前，国内外暂时没有针对中国白酒中EC的最大限量，但随着人们对食品安全的日益关注以及中国白酒不断走向世界，尤其是以茅台为代表的酱香型白酒，对饮料酒安全方面的要求必将不断提高。

目前，有关EC检测的主要方法有GC-MS、LC-MS及HPLC-FLD等[8-10]，其中我国强制标准GB 5009.223—2014《食品安全国家标准 食品中氨基甲酸乙酯的测定》是现阶段最常用的检测方法[11]，采用的是固相萃取-气相色谱-质谱（GC-MS）法，该方法具有灵敏度高、选择性好和稳定性强等特点，但样品的前处理过程较为繁琐，检测成本较高。为提高试验效率、简化前处理过程、节约试验成本，试验比较了液-液萃取和固相萃取2种前处理方式对EC提取的效果。同时，对来自100多家酒厂的326个酱香成品酒中的EC含量的监测结果进行数据分析（2018—2019年），并对酱香成品酒中的EC进行风险评估，为进一步研究我国酱香白酒中EC提供数据支持，也为监管部门制定白酒中EC的限量标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，5975C+7890A，EI源）；Milli-Q超纯水装置（美国，Millipore）；电子天平（梅特勒，感量为0.000 1 g）；旋涡混合仪（上海沪西分析仪器有限公司）。

氨基甲酸乙酯标准物质（纯度99.0%，阿拉丁）；d5-氨基甲酸乙酯（纯度98.0%，阿拉丁）；氯化钠（分析纯，国药试剂）；乙酸乙酯（色谱纯，Fisher）；碱性硅藻土（Cat：HC1001000-9，Agela Technologies）；EC检测专用商品柱（LOT：SBEQCA3999，CNW Technologies）。

酒样：共326个酒样，均为酱香成品酒（51%vol～ 54%vol）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

液-液萃取法：准确移取2.0 mL酒样于具塞玻璃离心管中，然后移取50 μL 5 μg/mL的氨基甲酸乙酯内标（d5-EC），加入0.5 g NaCl，涡旋振荡溶解、混匀后，准确加入2.0 mL乙酸乙酯，振荡提取5 min，静置分层后，吸取上层清液，待GC-MS上机分析。

固相萃取法：1）商品柱，参考标准GB 5009.223—2014[11]的方法，准确移取2.0 mL酒样于具塞玻璃离心管中，然后加入50 μL 5 μg/mL的氨基甲酸乙酯内标（d5-EC）、0.3 g氯化钠，超声溶解，混匀，加样到固相萃取柱上，在真空条件下将样品溶液缓慢渗入萃取柱中，静置10 min。经10 mL正己烷淋洗，用10 mL 5%乙酸乙酯-乙醚溶液以约1 mL/min流速进行洗脱，洗脱液经装有2 g无水硫酸钠脱水后，收集于10 mL氮吹管中，室温下氮气吹至约0.5 mL，甲醇定容至1.00 mL制成待测液，供GC/MS分析。2）手动填充固相萃取柱，准确称取4 g碱性硅藻土填充至10 mL的塑料针筒中（底部垫适量脱脂棉），制成固相萃取柱，其他前处理步骤同1）。

空白样，用无水乙醇配制成53%vol酒精水溶液，其他处理同上。

1.2.2 GC-MS条件

气相色谱条件：色谱柱，Agilent HP-INNOWAX石英毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度，220 ℃；载气，氦气，纯度≥99.99%；流速，1 mL/min；进样方式，不分流进样；进样体积，1 μL。程序升温：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃。

质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度，300 ℃；扫描范围，m/z 45～600；采用多反应监测（T-SRM）模式。EC选择监测离子m/z 44，62和89，定量离子m/z 62；d5-EC选择监测离子m/z 64，44和89，定量离子m/z 64。

1.2.3 标准曲线

EC、d5-EC标准储备液：分别准确称取0.01 g（精确到0.000 1 g）EC和d5-EC标准品，分别置于两个10 mL的容量瓶中，加入色谱甲醇溶解后，定容至刻度，质量浓度为1.0 mg/mL。

标准曲线工作液：用色谱甲醇对EC标准储备溶液进行梯度稀释，得到10，20，50，100，200和400 ng/mL系列标准工作溶液（内含125.0 ng/mL的d5-EC）。

1.2.4 计算公式

1) EC含量按式（1）计算。

式中：X为样品中EC的含量，μg/L；C为标准曲线定量的样品中EC的质量浓度，ng/mL；C0为空白EC的质量浓度，ng/mL；V为提取液体积，mL；v为取样体积，g；d为稀释倍数。

2) 暴露边界比（Margin of Exposure，MOE）按式（2）计算[12]。

式中：MOE为暴露边界值；BMDL为基准剂量下限，为动物实验得到的基准剂量下限值，mg/（kg·bw）；人群估计摄入量表示调查所得到的人群估计摄入值，mg/（kg·bw）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及检出限

由图1可知，d5-EC与EC的保留时间分别为13.645和13.735 min。

图1 EC及d5-EC的总离子色谱图

以EC与内标d5-EC响应之比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线见图2。EC在10～400 ng/mL质量浓度范围内线性良好，回归方程：Y=1.470X+0.006 693，相关系数r2=1.000，以信噪比（S/N）的3倍计算检出限，当取样量为2.0 mL时，EC的方法检出限为1.2 μg/L。

图2 EC的标准曲线

2.2 不同前处理方法的回收率

准确移取2 mL酱香酒样，检测其EC的本底值，为56.01 μg/L。之后分别加入50，100和150 ng/mL的EC标准品溶液（内含125 ng/mL的d5-EC），每个浓度做3个平行，进行加标试验，计算EC的平均回收率和相对标准偏差（RSD），比较液-液萃取法和固相萃取法两种前处理方式的提取效果，结果见表1。

液-液萃取法和固相萃取法（商品柱）均具有很好的回收率（回收率范围在92.50%～102.12%之间），精密度也均很好（RSD＜3.64%），二者差异不明显。手动填充的固相萃取柱的回收率（83.62%～ 90.93%）和精密度（3.99%～8.55%）均较之前二者要低，这与人工手动填充的固相萃取柱中的碱性硅藻土的密度不均匀，上样及洗脱的过程中易产生气泡有关，影响了回收率和稳定性。由于固相萃取法的前处理过程较为复杂，较为耗费时间，而且商品柱的费用高，因此试验采用液-液萃取的前处理方法。

2.3 方法的精密度

选取3个EC含量不同的酱香成品酒，每个样品做3个平行，按照1.2.1的方法（液-液萃取法）进行前处理，上机分析，根据所得EC结果计算方法精密度（RSD），结果见表2。3个酱香型白酒中的EC所测数据的RSD＜2.91%，方法精密度良好。

表1 不同萃取方式EC的加标回收率

表2 EC检测方法的精密度

2.4 酱香成品白酒中EC含量的分布MOE危险性评估

酱香成品酒中EC的检测结果及分布情况见图3和表3。结果显示，326份酱香成品酒中，99.4%的酒样中检出了EC，平均含量为86.9 μg/L，其中有10.4%的酒样EC含量超过了加拿大规定的蒸馏酒中EC的限量标准（150 μg/L），最高含量达359.4 μg/L，为限量标准的2.4倍。

图3 酱香成品酒EC含量散点图

EC的基准剂量下限值（BMDL）每天为0.3 mg/（kg·bw）[13]。根据《2018年度酱酒报告》[14]，2018年全国酱香白酒总销售量约6×108L，酱香型白酒的消费人群占比在20%左右，对应2018年人口（139 538万人）比值得到人均饮酒量为0.005 9 L/d。按酱香成品酒EC含量的平均水平（86.9 μg/L）计算，不考虑其他EC摄入途径，人群估计摄入量每天为8.55 ng/（kg·bw）（人群标准体重以60 kg计），MOE值为35 088。基于动物实验数据，当MOE值＜10 000时，致癌风险较大，MOE越小，致癌风险越大[15]。由此可知，酱香型白酒中EC对人群的致癌风险相对较小。

表3 酱香成品酒中的EC含量

3 结论

采用GC-MS法对酱香型白酒中的EC进行检测分析，比较了液-液萃取法和固相萃取法两种前处理方式，结果发现液-液萃取法与固相萃取法（商品柱）的回收率和精密度均很好；而手动填充的碱性硅藻土固相萃取柱的回收率和精密度均低于二者。从前处理步骤的难易程度及试剂耗材的成本考虑，最终选择液-液萃取法作为此次试验的前处理方法。该方法提高了提取效率，节约了试验成本，缩短了分析时间，适合大批量样品的实验分析，EC的加标回收率为92.5%～100.23%，检出限为1.2 μg/L，相关系数r2=1.000，精密度RSD＜3%，表明该方法稳定、灵敏度高。

此次试验发现326份酱香成品酒中有99.4%的酒样检出EC，表明EC普遍存在于酱香型白酒中，EC的平均含量为86.9 μg/L，其中10.4%的酒样中EC的含量高于国际常用蒸馏酒限量标准（150 μg/L）。酱香成品酒中EC的MOE值为35 088，致癌风险相对较低，但不同酒厂的生产工艺各异，EC含量相差也较大，最高含量可达359.4 μg/L，为国际常用蒸馏酒限量标准的2.4倍，因此降低酱香白酒中EC的含量势在必行，而现阶段我国尚无标准规定白酒中EC的限量，应尽快制定相应的国家标准，以标准促进生产、规范生产，才能更好地保护消费者的饮食健康。