响应面优化花生芽中白藜芦醇提取工艺

武鹏程，蒲云峰，张斌，张金荣，王丽玲，王强

塔里木大学生命科学学院，南疆特色农产品深加工兵团重点实验室（阿拉尔 843300）

花生（Arachis hypogaeaL.）是蔷薇目、豆科、落花生属的一年生草本植物，在亚洲、非洲和美洲等国家均有种植，我国新疆花生的种植已有100多年的历史，因地处内陆腹地，具有典型的温带大陆性气候，气候干燥，降雨量少，种植花生具有不易滋生黄曲霉毒素的绿色优势[1]。花生营养丰富，其蛋白质含量约为25.8%，脂质含量为49.2%，碳水化合物含量为16.1%，水分含量为6.5%，灰分含量为2.3%。此外，花生还富含维生素C[2]、白藜芦醇（Resveratrol，Res）等[3]。研究发现，花生萌芽后蛋白质逐渐降解为肽和氨基酸，其生物利用率显著提高，脂肪含量显著降低，维生素含量全面提高，营养因子得到改善，特别是具有重要生理功能的多酚类物质Res含量迅速增加[4]。

白藜芦醇（Res）是一类天然非黄酮类多酚，广泛存在于虎杖、花生、葡萄、桑葚等植物中[5]，是植物在受到诱导胁迫时自发启动防御机制而大量产生的一种植物抗毒素[6]。Res无色、无味，难溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，学名为3, 4, 5-三羟基二苯乙烯，分子式为C14H12O3，自然界中Res主要以顺式Res苷和反式Res苷两种形式存在[7]，具有抗癌、抗过敏、抗氧化、抗动脉粥样硬化、调节油脂代谢、保护心血管等多种生理活性功能[8-9]。以Res为主要成分的保健品，在美国、日本、加拿大等国家早已广泛被消费者接受；在我国，近年来随着研究者不断的深入研究和推广，Res相关产品也在逐渐被人们接受，呈现潜在良好的经济效益及社会效益[10]。

此次试验以新疆阿拉尔花生为原料，经发芽后使用超声波辅助纤维素酶法提取Res，以期为Res的提取提供理论依据。

1 试验部分

1.1 材料与仪器

花生芽：取颗粒饱满，大小相等完整的花生，整齐、等距摆放在已灭菌的塑料育苗托盘上，将培育盘压水盘依次装入豆芽机中，避光，透气，在25～30 ℃条件下培养50 h，期间每隔1 h浇1次水，每隔4 h换1次水，将发芽后的花生（长约15 cm）洗净，沥干，于50 ℃烘24 h，粉碎，备用。

Res标准样品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇、甲醇（分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）；纤维素酶（山东西亚化学股份有限公司）。

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）；JP-060S型数控超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；SHA-B型水浴恒温振荡器（江苏金怡仪器科技有限公司）；RE-3000A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DYJ-2016豆芽机（中山市德容电子科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Res的测定

色谱柱，ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为甲醇；流动相B为0.5%甲酸；流速0.7 mL/min；柱温30 ℃；检测波长305 nm。

1.2.2 Res标准曲线的建立

精确称取5 mg Res标准品，用50 mL甲醇溶解并定容成100 μg/mL的储备液。将储备液进行一定梯度的稀释，配制成0.2，1，2，5，10，20，40和80 μg/mL的对照液。

将制备的对照液经微孔滤膜过滤后上高效液相色谱，测定其峰面积，得线性方程：Y=122 979X-128 545（R2=0.998 4）。式中，X为质量浓度；Y为不同浓度下的相应峰面积。结果显示，此曲线在一定范围内的线性关系良好，适合用于Res的测定。

1.2.3 Res的提取

以料液比、超声温度、时间和酶添加量4个因素进行单因素试验，精确称取1.000 g备用花生芽粉，加入一定量的70%乙醇和纤维素酶，振荡混匀，在超声提取仪中调节不同温度提取一定时间，取滤液离心，过0.22 μm微孔滤膜，然后上高效液相色谱仪测定其含量，每次试验重复3次，结果取平均值。由线性回归线性方程得出Res浓度。式（1）计算Res提取率。

Res提取率（mg/g）=C×V/M×稀释倍数 （1）

式中：M为花生芽粉的质量，g；V为提取液稀释后的体积，mL；C为测定的样液中Res质量浓度，μg/mL。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对花生芽中Res提取率的影响

准确称取适量花生芽粉，纤维素酶添加量为8 mg/g，提取溶剂为70%乙醇，料液比为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），在50 ℃的条件下酶解1.5 h，经40 kHz超声波处理30 min，分析料液比对Res提取率的影响，结果如图1所示。

随着料液比的增加，Res提取率增加，当料液比为1∶40（g/mL）时，提取率达到最大；料液比超过1∶40（g/mL）后，Res提取率略有下降，这是由于当溶质的量一定时，增加溶剂的量有利于原料中有效成分向浸提液中扩散，提高Res的浸出率，但继续增加浸提溶剂，原料中的有效成分会被稀释。综合考虑提取率和经济效益的影响，选择料液比1∶40（g/mL）为宜。

图1 料液比对花生芽中Res提取率的影响

2.1.2 超声波温度对花生芽中Res提取率的影响

准确称取5份1.000 g花生芽粉，纤维素酶添加量为8 mg/g，提取溶剂为70%乙醇，在料液比1∶40（g/mL）的条件下酶解1.5 h，分别经30，40，50，60和70 ℃的40 kHz超声波处理30 min，分析超声波温度对Res提取率的影响，结果如图2所示。

随着超声波处理温度的提高，Res提取率增加，当超声波处理温度为50 ℃时，提取率达到最大；超声波处理温度超过50 ℃后，Res提取率下降，这是由于根据布朗运动原理，温度升高，组织内的分子运动加剧，扩散和渗透速度加快，溶出的Res增加，但继续提高超声波处理温度，会导致热敏性Res丧失生理活性。因此，提取温度选择50 ℃最佳。

图2 超声波温度对花生芽中Res提取率的影响

2.1.3 超声波时间对花生芽中Res提取率的影响

准确称取5份1.000 g花生芽粉，纤维素酶添加量为8 mg/g，提取溶剂为70%乙醇，在料液比1∶40（g/mL）的条件下酶解1.5 h，置于50 ℃ 40 kHz的超声波提取10，20，30，40和50 min，分析超声波处理时间对Res提取率的影响，结果如图3所示。

随着超声波处理时间的延长，Res提取率增加，当超声波处理时间为30 min时，提取率达到最大；超声波处理时间超过30 min后，Res提取率下降，其原因可能是随着处理时间的延长，花生芽细胞破碎程度增强，溶出的Res增加，但继续增加超声波处理时间，Res的稳定性会被破坏，导致含量降低，因此确定超声波处理时间30 min。

图3 超声时间对花生芽中Res提取率的影响

2.1.4 酶添加量对花生芽中Res提取率的影响

准确称取5份1.000 g花生芽粉，提取溶剂为70%乙醇，料液比为1∶40（g/mL），分别添加6，8，10，12和14 mg酶，在50 ℃条件下酶解1.5 h，经40 kHz超声波处理30 min，分析酶添加量对Res提取率的影响，结果如图4所示。

当酶添加量为8 mg时，Res提取率最大；继续增加酶的添加量，Res提取率反而下降，其原因可能是大量纤维素酶过分分解花生芽，导致Res提取率下降。因此，酶添加量选择8 mg左右为宜。

图4 酶添加量对花生中Res提取率的影响

2.2 响应面试验结果

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken设计原理，以花生芽中Res提取率为响应值，选取超声波温度（A）、超声时间（B）、料液比（C）、酶添加量（D）为自变量，以Res的提取率为响应值，设计响应面试验，因素水平见表1，试验结果见表2，回归模型方差分析见表3。

利用Design-Expert V 8.0.6.0软件统计分析，由花生芽中Res的浓度（Y）对超声温度（A）、超声时间（B）、料液比（C）、酶添加量（D）建立回归模型，对表2中的试验数据进行多元二次多项式回归拟合，得到的四元二次回归方程：

Y=+5.43+0.023A-0.097B+0.033C-0.046D-0.093AB+ 0.003 815AC+0.050AD-0.092BC+0.20BD-0.49CD-4.16A2+0.75B2+0.49C2+0.43D2

由表3可知，模型线性以及平方均显著，失拟项不显著，表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小。回归方程较好地描述了各因素与响应值之间的真实关系，因此，可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。由表3可知，所选取的因素对Res提取率的影响为B＞D＞C＞A，即超声时间对Res提取率的影响最大，其次为酶添加量，最后是料液比和超声温度。

表1 响应面试验因素水平表

表2 响应面试验结果

由该回归方程作出中心组合设计试验所得的6组响应面曲面图，如图5～图10所示，以确定最佳提取工艺条件。由此可知，Res理论最大提取率为0.805 8 mg/g，其所对应的提取条件为超声温度49.98 ℃，超声时间35.00 min，料液比1∶34.99（g/mL），酶添加量7 mg。

根据软件得到的结果，但考虑实际的操作性，建议对影响因素较小的超声温度和料液比进行合理控制，将最佳反应条件调整为超声温度50 ℃，超声时间35 min，料液比1∶35（g/mL），酶添加量7 mg。在此条件下，Res提取率为0.823 9 mg/g，验证了方程的可靠性。

表3 回归方程的方差分析

图5 超声时间和超声温度交互作用对花生芽中Res提取率的影响

图6 料液比和超声温度交互作用对花生芽中Res提取率的影响

图7 酶添加量和超声温度交互作用对花生芽中Res提取率的影响

图8 料液比和超声时间交互作用对花生芽中Res提取率的影响

图9 酶添加量和超声时间交互作用对花生芽中Res提取率的影响

图10 酶添加量和料液比交互作用对花生芽中Res提取率的影响

2.3 验证比较试验

由表4可知，超声波纤维素酶复合提取法的Res提取率最高。

表4 4种不同提取方法比较

3 结论

利用响应面法优化超声波辅助纤维素酶提取花生芽中Res。结果表明，Res最佳提取工艺条件为超声波处理温度50 ℃，超声波处理时间35 min，料液比1∶35（g/mL），酶添加量7 mg。在此条件下，Res的最大提取率可达0.823 9 mg/g，与理论预测值相接近。通过比较验证，结果表明超声波辅助纤维素酶提取工艺能更有效地提取花生芽中Res，并优于超声波或纤维素酶单一提取工艺。花生发芽后大大提高了Res的含量，是Res的良好来源。花生发芽后提取Res，为花生仁的深加工提供了新的思路，并具有潜在的经济价值和应用价值。