生物炭固定微生物对草甘膦的去除效果研究*

陈楸健 周 玲 梁 媛

(苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏 苏州 215000)

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导性有机磷除草剂，被广泛应用于防治农田草害。草甘膦的极性强，会被土壤和底泥大量吸附，从而恶化土壤和水环境[1]，抑制微生物酶活性[2]，影响非靶目标植物生长[3]，长期接触草甘膦污染土壤或水源甚至会影响胎儿发育[4]。通常人们利用生物炭的吸附效应处理水或土壤中的有机污染物。研究表明，生物炭对0～6 mg/L草甘膦的吸附效果较土壤颗粒高400～2 500倍，可通过吸附作用去除土壤中的草甘膦[5]。微生物因其生物降解效应被广泛研究，在实验室模拟条件下，高效降解菌分枝杆菌(Mycobacteriumsp.) ESG4可使土壤中50 mg/kg的草甘膦降解68.89%[6]。TANG等[7]从草甘膦污染水灌溉的农田土壤中筛选出高效降解菌，在60 d内可降解0.59 mmol的草甘膦。

单一生物炭或微生物均可去除草甘膦，但仍存在一些问题，如生物炭会受土壤粒径[8]、阳离子交换量(CEC)[9]、pH[10]等理化性质影响，使其对草甘膦的吸附容量产生较大波动，无法稳定吸附草甘膦。纯菌在真实环境中由于条件恶劣且竞争力逊于土著菌，其草甘膦降解能力大幅下降甚至消失[11]。固定化微生物技术可将微生物固定于生物炭上制成特定大小、形状的复合材料颗粒，以提高微生物密度和活性，提高处理负荷，增强微生物对不同浓度、温度、pH等环境条件的适应力[12]。微生物还可改变生物炭表面的疏水性和极性[13]，从而提高复合材料与草甘膦的亲和力，同时微生物具有降解草甘膦的作用，因此复合材料具有更高效修复草甘膦的潜能。若以生物炭为载体固定草甘膦降解菌，能发挥生物炭与功能菌各自的优势，可提高对草甘膦的去除效果。因此，本研究以芦苇生物炭为载体固定草甘膦降解菌，通过对比单一生物炭、单一微生物和复合材料对草甘膦的去除效果，探究生物炭固定微生物是否能发挥吸附和降解的双重功效从而提高对草甘膦的去除效果并阐述其机制。

1 材料与方法

1.1 原料的制备

生物炭：芦苇粉碎，限氧，550 ℃下慢速热解3 h后得芦苇生物炭[14]。将制得的芦苇生物炭研磨，过100目筛，密封备用。

草甘膦降解菌：从某长期施用草甘膦的农田土壤中富集驯化得到。按照文献[15]培养得到草甘膦降解菌菌液。

1.2 复合材料的制备

取1.0 g生物炭置于150 mL三角瓶中，加入10 mL LB培养液混匀，121 ℃下灭菌30 min，取出冷却至室温。向三角瓶中加入100 mL接种草甘膦降解菌菌液(接种量4%(体积分数)) 的LB培养液，30 ℃、200 r/min振荡培养24 h完成吸附固定。将混合液过200目筛网，并用无菌水冲洗筛网上的材料以去除游离菌得到复合材料。将复合材料风干至含水率为30%，存于4 ℃冰箱备用。

1.3 草甘膦去除实验

(1) 微生物组：在250 mL锥形瓶中各加入200、400、800 mg/L草甘膦培养液200 mL，按4%接种量接种草甘膦降解菌菌液，30 ℃、200 r/min振荡，分别于1、3、5、18、24、48、72 h用滤头取2 mL样液，测定草甘膦浓度、600 nm处的吸光度(OD600)。

(2) 生物炭组：取0.2 g生物炭置于250 mL锥形瓶中，其余操作同微生物组，测定草甘膦浓度及溶液pH。

(3) 复合材料组：取0.2 g复合材料置于250 mL锥形瓶中，其余操作同生物炭组。

1.4 分析测试和计算方法

采用《草甘膦水剂》(GB/T 20684—2017)中紫外分光光度法测定草甘膦浓度。全自动比表面积测定仪(V-sorb2 800)测定材料比表面积。扫描电子显微镜(Quanta FEG 250)对材料表面形貌结构与元素进行分析。傅立叶红外光谱(FT-IR)仪(Thermo 6700型)对材料的表面官能团进行分析。高分辨电位及粒度分析仪(ZetaPALS)测定材料分散在溶液中电位为0 mV时的溶液pH(记为ζ0)。

草甘膦去除量以草甘膦浓度差和溶液体积的乘积计算。

2 结果与讨论

2.1 草甘膦的去除效果比较

2.1.1 微生物

由图1(a)可知，当草甘膦初始质量浓度为200～800 mg/L时，微生物的生长呈现迟缓期、对数期和平稳期。随草甘膦初始浓度升高，微生物的生长速度和平稳期的生物量逐渐降低，表明高浓度草甘膦对微生物的生长有一定的抑制作用。由图1(b)可看出，微生物对草甘膦的去除量随微生物生长同步提高，72 h时，200、400、800 mg/L的草甘膦的去除量分别为26.71、22.84、19.52 mg，随草甘膦初始浓度增加而降低，表明虽然草甘膦浓度越高可能会提供更多底物供微生物降解代谢，但草甘膦毒性也随之提高，阻碍微生物对其降解利用。

图1 微生物在不同初始质量浓度草甘膦中的生长及对草甘膦的降解Fig.1 Microbial growth and degradation of glyphosate under different initial mass concentrations of glyphosate

2.1.2 生物炭

由图2(a)可知，当草甘膦初始质量浓度为200、400、800 mg/L时，生物炭吸附草甘膦的速率较快，5 h时，生物炭对草甘膦的去除量分别已达最终去除量的76.52%、77.32%和75.69%；5～18 h，生物炭对草甘膦的吸附迅速减缓，并在24 h后趋于平稳；72 h时，生物炭对草甘膦的去除量分别为23.56、30.20、32.78 mg，生物炭对草甘膦的去除量随草甘膦初始浓度提高而增加，但增量明显减小，可能是生物炭接近饱和吸附，表面点位不足以吸附过量的草甘膦。由图2(b)可知，当草甘膦初始质量浓度为200～800 mg/L时，吸附过程中溶液pH变幅为4.41～5.17。草甘膦在pH>2.29的溶液中会解离出H+，H+被生物炭中的碱性成分中和，在一定程度上维持了pH的相对稳定，且随草甘膦被生物炭吸附，解离的H+逐渐减少，从而使溶液pH提高。

2.1.3 复合材料

由图3(a)可知，草甘膦去除量随初始浓度的提高而增加但增量逐渐减小。当草甘膦初始质量浓度为200、400、800 mg/L时，72 h时去除量分别为40.69、52.12、64.14 mg，比微生物组提高52.34%、128.20%、228.59%，比生物炭组提高72.71%、72.58%、95.67%，表明将生物炭作为载体固定草甘膦降解菌可有效提高草甘膦的去除效果。当草甘膦初始质量浓度为200～800 mg/L时，溶液pH为4.38～4.96(见图3(b))，会一定程度上减小草甘膦降解菌活性，降低复合材料表层降解菌的降解效果。

前5 h，3种材料对草甘膦的去除量为生物炭>复合材料>微生物，生物炭对草甘膦的吸附作用显著高于微生物对草甘膦的降解作用。该阶段复合材料去除草甘膦主要依靠生物炭的吸附作用，由于复合材料表面菌膜覆盖阻碍了草甘膦向材料内部扩散，因此对草甘膦的去除量和去除速率均小于生物炭。5 h后，生物炭对草甘膦的吸附趋缓，微生物对草甘膦的去除量仍较小，而复合材料对草甘膦的去除量却迅速增加，草甘膦克服表面菌膜阻力，开始向复合材料内部孔道迁移扩散。18 h后，生物炭由于表面吸附点位接近饱和，对草甘膦的去除量基本达到平衡，微生物因进入对数生长期，对草甘膦的去除量开始增加，但单一微生物易受草甘膦毒性抑制，其对草甘膦的最大去除量仅为26.71 mg。生物炭能为微生物提供其生长的必要养分和场所，降低草甘膦对微生物的抑制作用，因此在复合材料系统中，生物炭作为微生物载体的作用显著，生物炭的吸附作用与微生物的降解作用同时发挥作用，产生协同效果，对更高浓度的草甘膦去除量较单一生物炭或微生物进一步增大。

图2 生物炭对不同初始质量浓度草甘膦的吸附效果Fig.2 Adsorption effect of biochar on glyphosate with different initial mass concentrations

图3 复合材料对草甘膦的去除效果Fig.3 Removal of glyphosate by composite materials

当草甘膦初始质量浓度为800 mg/L时，采用准一级反应动力学方程(见式(1))和准二级反应动力学方程(见式(2))对生物炭和复合材料去除草甘膦的过程进行分析，计算所得动力学参数见表1。生物炭去除草甘膦的反应动力学更符合准一级反应动力学方程，表明生物炭去除草甘膦的过程主要受草甘膦初始浓度控制。复合材料去除草甘膦的反应动力学更符合准二级反应动力学方程，表明草甘膦初始浓度并不是控制反应速率的唯一因素，可能还存在固液界面上的电子共用或转移和共价键作用。

qt=qe[1-exp(k1t)]

(1)

(2)

式中：t为时间，h；qt、qe分别为t时刻、平衡时单位质量材料对草甘膦的去除量，mg/g；k1为准一级反应动力学速率常数，h-1；k2为准二级反应动力学速率常数，g/(mg·h)。

2.2 生物炭、微生物和复合材料去除草甘膦机理分析

2.2.1 吸附机制

由表2可知，生物炭和复合材料的ζ0分别为2.92和5.10。ζ0可反映材料在不同pH溶液中表面电荷的情况。当溶液pH小于材料的ζ0时，材料表面带正电，反之则带负电(见图4)。草甘膦分子具有强极性，在溶液pH大于一级解离常数(pK1，2.29)和二级解离常数(pK2，5.96)时，会在水中电离出数个H+，分别形成C3H7NO5P-和C3H6NO5P2-，带负电[16]。由图2和图3可知，生物炭和复合材料溶液pH在4.38～5.17，此时草甘膦主要以C3H7NO5P-形式存在，带负电。生物炭组：pK2<生物炭ζ0(2.92)<溶液pH(4.41～5.17)，生物炭表面带负电荷，与草甘膦电荷相斥。复合材料组：pK2<溶液pH(4.38～4.96)<复合材料ζ0(5.10)，复合材料表面带正电荷，有利于通过静电力吸附草甘膦。

材料表面的扫描电镜图见图5。微生物及菌膜大量覆盖在生物炭表面，使其高度变形，孔径分布不规则，一定程度上丰富了生物炭表面孔道结构和吸附位点，有利于吸附更多的草甘膦。但由于生物炭表面被大量菌膜覆盖，草甘膦需克服菌膜阻力，膜扩散时间延长，且扩散速率受限，导致5 h前复合材料对草甘膦的去除速率和去除量均小于生物炭。

由图6可知，生物炭在固定微生物后3 433 cm-1处的峰发生偏移，可能是生物炭固定微生物时酚羟基发生反应；复合材料比生物炭新增了2 964、1 455、1 084 cm-1处的特征峰，是被固定的微生物细胞膜表面脂肪酸、蛋白质酰胺和多糖类物质[17]。反应后复合材料在3 410、1 662 cm-1处的峰发生偏移，分别是酚羟基和羧基以化学作用和氢键的形式参与固定草甘膦[18-19]；1 394 cm-1处新增一个峰，是pH较低时草甘膦分子表现出的强阳离子-π键，与草甘膦分子形成π+-π相互作用形成的C—N键[20]，从而形成多层吸附；2 964、1 455 cm-1处特征峰消失，1 084 cm-1处特征峰偏移，表明细胞膜表面脂肪酸、蛋白质酰胺和多糖类物质参与了草甘膦的去除过程[21]。因此，与生物炭相比，复合材料可提供更多的吸附点位，通过强化酚羟基、羧基等化学键，多层吸附和微生物表面脂肪酸、蛋白质酰胺和多糖类物质的生物反应等作用方式，提高化学吸附能力，吸附更多的草甘膦。

表1 生物炭和复合材料对草甘膦的反应动力学参数

表2 材料的基本理化性质

图4 材料在不同溶液pH下的ζ0Fig.4 ζ0 of materials with different pH

图5 材料表面的扫描电镜图Fig.5 SEM image of surface of materials

图6 材料的FT-IR图谱Fig.6 FT-IR spectra of materials

2.2.2 降解机制

生物炭中的全氮、全磷分别为127、63.5 mg/kg，可为微生物提供充足的养分，提高微生物密度和活性，固定微生物后生物炭的pH由8.63降至7.54，更符合微生物的生长条件。生物炭固定微生物后比表面积降低了22.97%，孔体积降低了24.12%，相对较低的比表面积不会导致草甘膦的生物利用性降低，因此生物炭可作为微生物良好的载体，提高微生物抵御高浓度草甘膦的能力，增强微生物对草甘膦的代谢能力。

草甘膦的降解途径主要有两条：被降解为乙醛酸和氨甲基磷酸；被降解为肌氨酸。测定草甘膦为800 mg/L时复合材料组和生物炭组中乙醛酸和肌氨酸浓度，判断是否有草甘膦降解及其降解途径。生物炭组溶液中未检出乙醛酸和肌氨酸，表明生物炭对草甘膦没有降解作用。复合材料组检测出乙醛酸(见图7)，未检测到肌氨酸，表明微生物通过乙醛酸和氨甲基膦酸途径对草甘膦进行降解。乙醛酸浓度呈先升后降的趋势，可能是本实验微生物是具有草甘膦降解功能的混合菌群，前中期菌群中优势菌为草甘膦降解菌，当乙醛酸达到一定浓度后利用乙醛酸的菌成为优势菌，乙醛酸消耗量高于草甘膦降解产生的乙醛酸量，具体机制需进一步探究。

图7 复合材料组溶液中乙醛酸质量浓度Fig.7 Mass concentration of glyoxylic acid in composite solution

3 结 论

(1) 微生物对草甘膦的去除量随草甘膦初始浓度增加而减小，72 h时200、400、800 mg/L的草甘膦的降解去除量分别为26.71、22.84、19.52 mg，草甘膦会抑制微生物生长，降低其降解效果。

(2) 生物炭可快速吸附草甘膦，5 h的去除量可达最终去除量的75%以上，生物炭对草甘膦的去除量随草甘膦初始浓度提高而增加，72 h时200、400、800 mg/L的草甘膦的吸附去除量分别为23.56、30.20、32.78 mg。

(3) 复合材料可去除更多的草甘膦，72 h时200、400、800 mg/L的草甘膦的去除量分别为40.69、52.12、64.14 mg，比微生物组提高52.34%、128.20%、228.59%，比生物炭组提高72.71%、72.58%、95.67%。

(4) 固定的微生物会在生物炭表面覆盖菌膜，改变生物炭微观形态，提高材料ζ0，增强酚羟基、羧基等表面官能团和化学键作用，提高生物炭对草甘膦的静电和化学吸附能力。生物炭可为微生物提供养分和附着空间，提高微生物抵御高浓度草甘膦的能力，有利于提高微生物的草甘膦降解能力。