植物种质资源超低温保存的研究进展

俞晓凤,曾晓健,封昀,刘霞霞,陈晓恬,刘洁,尹明华

(上饶师范学院 生命科学学院,江西 上饶 334001)

植物种质资源是生物多样性的基础,也关系到一个国家的经济命脉。到目前为止,地球上的植物种类约有55 万种,仅有1 500多种被人类利用[1]。随着生物技术在人类生活中的广泛应用,人类对植物种质资源的依赖程度越来越高,但植物种质资源在人类的开发和利用中逐渐变得狭窄,甚至有些物种的野生资源已经濒临灭绝[2]。再加上随着人口膨胀、土地开发、环境恶化和现代农业的发展,品种单一化在世界范围内愈演愈烈[3]。因此,对植物种质资源进行保存具有重大的现实意义。

植物种质资源一般采用原地保存(In situ conservation)和异地保存(Ex situ conservation)两种方式[3]。原地保存容易受到自然灾害和病虫害的侵袭造成种质丢失,而常规的异地保存如建立种质圃、种子库和植物园等方式也存在栽培环境不适和管理粗放等问题,易引起种性退化[4]。况且原地保存和常规异地保存均需要耗费大量的物力、人力和财力[5]。鉴于此,通过植物组织培养技术实现种质资源的另一类异地保存方式即离体保存(In vitro conservation)技术应势而生。植物种质资源离体保存技术是利用植物生物技术手段对植物材料进行无菌培养,在培养过程中添加各类生长抑制条件,延缓或停止其生长,减少其继代培养时间,以达到植物种质资源中长期保存的目的[6]。离体保存技术一般有两种,一种是缓慢生长离体保存,另一种是超低温离体保存[7]。这两种离体保存方式可以打破植物生长季节限制,具有贮存空间小、劳动力和维持开支少、便于种质运输和国际交流等优点,可防止田间地头多代繁殖造成种性退化及病毒感染,保证了种质的优良性和遗传稳定性,得到了世界各国的重视[8－9]。但缓慢生长离体保存是在常规培养条件下对培养材料限制生长保存的方法,保存时间较短,还需要定期继代,易造成人为失误混淆和污染,甚至会引起遗传变异[10]。超低温保存(cryopreservation)是指在－80 ℃以下的温度(一般用液氮为冷源,－196 ℃)下对植物种质资源进行保存的技术[11]。在此极低的温度下,植物材料代谢和衰老基本中止[11],无须继代,无变异发生,可以减少工作量,减少污染机会,是目前植物种质资源保存最理想最安全稳定的方式[12－13]。超低温保存一般有4种方法,即玻璃化法超低温保存、小滴玻璃化法超低温保存、包埋玻璃化法超低温保存和包埋脱水法超低温保存。本文对这4种方法进行概述,旨在阐明植物种质资源超低温保存的研究现状,为植物种质资源超低温保存的后续研究提供一个大致的方向。

1 玻璃化法超低温保存

玻璃化法超低温保存(cryopreservation by vitrification)是植物材料经高浓度玻璃化保护剂处理后进行液氮保存的方法[14]。其基本程序是:预培养、体积分数60% PVS2(plant vitrification solution,MS ＋质量浓度300 g/L 甘油＋质量浓度150 g/L聚乙二醇＋质量浓度150 g/L二甲基亚砜＋摩尔浓度0.4 mol/L 蔗糖,p H＝5.8)装载体积分数100%PVS2脱水、液氮保存、化冻、洗涤、冻后培养等环节[15]。Sakai等[16]采用玻璃化冷冻法成功地保存了脐橙(Citrus sinensis Osb.var.brasiliensis Tanaka)的珠心细胞,通过体积分数60%PVS2在25 ℃条件下装载5 min以及体积分数100%PVS2在0 ℃条件下脱水3 min,平均成活率约80%,且整个程序完成仅需10 min 左右。Niino 等[17]通过玻璃化冷冻成功保存苹果(Malus domestica Borkh.cv.Fuji)离体培养的茎尖,通过5℃下MS＋摩尔浓度0.7 mol/L蔗糖培养基中预培养1 d以及25 ℃下PVS2液脱水80 min,平均成活率约为80%,且该方法成功应用于5个苹果品种和8个梨品种,是一种很有前途的果树试管苗茎尖超低温保存技术。Towill和Jarret[18]认为玻璃化冷冻是一种技术上简单的植物种质超低温保存方法,只需使用合适的超低温保护剂和快速降温,甘薯茎尖在玻璃化诱导预处理后,在液氮(－196 ℃)下存活;在生长培养基中,用含有质量浓度300 g/L 甘油、质量浓度150 g/L 乙二醇和质量浓度150 g/L二甲基亚砜的玻璃化溶液逐步地处理茎尖;茎尖在低浓度玻璃化液中孵育1～2h,可提高成活率;大多数存活的茎尖发育出愈伤组织,随后形成的芽的百分比是可变的,但采用两步冷却法不能获得生存。Sakai等[19]采用玻璃化法成功地保存了离体培养的芥末顶端分生组织,通过摩尔浓度2 mol/L 甘油和摩尔浓度0.4 mol/L蔗糖25 ℃装载20 min以及25 ℃PVS2脱水10 min,冻后正常芽的形成率约为80%～90%,且该方法已成功应用于其他三个芥末品种。Matsumoto等[20]采用玻璃化法成功地保存了日本粉百合鳞茎段培养诱导的不定芽顶端分生组织,切除的顶尖分生组织在含有摩尔浓度0.3 mol/L 蔗糖的固体MS培养基上预培养,在25 ℃下放置1 d,然后在25 ℃下转入摩尔浓度2 mol/L甘油加摩尔浓度0.4 mol/L蔗糖的装载液中装载20 min。然后在25 ℃下用PVS2充分脱水20 min,或在0 ℃下放置110 min,然后浸入液氮中。在40℃水浴中快速升温后,将分生组织放入1.8 m L摩尔浓度1.2 mol/L蔗糖中20 min,然后放置在固体MS培养基上的滤纸上。复苏的分生组织在5 d内恢复生长,直接产生新梢。4周后芽形成率约为80%。不定芽鳞片段在0 ℃低温处理7 d以上,成苗率显著提高。该方法已成功应用于其他5个百合品种。因此,玻璃化法超低温保存作为百合分生组织冷冻保存的常规方法具有广阔的应用前景。Channuntapipat等[21]采用一步玻璃化法成功地对两个杏接穗品种‘Ne Plus Ultra’和‘Nonpareil 15－1’以及一个杏桃杂交砧木的茎尖进行了超低温保存,‘Ne Plus Ultra’‘Nonpareil 15－1’以及杏桃杂交砧木的成活率分别为87.5%、60.0%和72.5%。Liu等[22]采用新的玻璃化溶液PVSL 对离体生长的苹果Gala茎尖进行了玻璃化冷冻保存,平均成活率和成芽率分别高达81%和77%;存活芽的再生模式和速度与未处理对照相同,并发育正常的芽和根;对照组与超低温保存组在芽长、叶形、叶宽长比、根长等形态特征上无显著差异(P＜0.05);冻后再生苗叶片不定芽的再生速度和频率与未冻对照相同;对照组与超低温保存组可溶性蛋白和POD 同工酶电泳谱带无明显差异;15对随机引物和6对AFLP引物在对照和冻后再生苗中均未检测到不同的RAPD 和AFLP片段;玻璃化法超低温保存是苹果种质资源长期保存的一种实用方法。Liu等[23]采用玻璃化法成功超低温保存了离体苹果茎尖,平均成活率和成芽率分别为80%和76%;冻后存活芽的生长速度和再生模式与未处理的对照相同;对照组与超低温保存组在芽长、叶形、叶宽长比、根长等形态特征上无显著差异(P＜0.05);用12对微卫星和11对ISSR 引物检测到对照和超低温保存的芽之间没有不同的微卫星等位基因和ISSR 片段;玻璃化法超低温保存是苹果种质资源长期保存的一种实用方法。朱东姿等[24]为有效保存甜樱桃矮化砧木吉塞拉的种质资源,对其玻璃化法超低温保存进行正交试验,建立和优化了其玻璃化法超低温保存技术体系,切取4 ℃低温锻炼组培苗茎尖,置于摩尔浓度0.3 mol/L蔗糖中预培养1 d,0 ℃下PVS3脱水60 min,茎尖的存活率最高且遗传稳定性好。吴怡等[15]以莪术组培苗茎尖为试材,建立了莪术茎尖玻璃化法超低温保存技术体系,2～3 mm 茎尖于MS＋摩尔浓度0.3 mol/L蔗糖的固体培养基上预培养7 d后,用体积分数60%PVS2室温下装载10 min以及0 ℃下体积分数100%PVS2脱水30 min,莪术茎尖的生活力高达100%。Antony等[25]对玻璃化法超低温保存后的Dendrobium Sabin Blue类原球茎进行了生化分析,结果表明,冻后Dendrobium Sabin Blue类原球茎叶绿素、胡萝卜素和卟啉含量显著下降,而且过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶的活性在玻璃化法超低温保存不同阶段出现了显著波动。

2 小滴玻璃化法超低温保存

小滴玻璃化法超低温保存(cryopreservation by droplet－vitrification)与玻璃化法较为相似,主要的区别是将高浓度玻璃化保护剂滴到铝箔条,再将铝箔条转移到冷冻管进行液氮保存。其基本程序是:预培养、装载液(MS＋摩尔浓度2 mol/L甘油＋摩尔浓度0.4 mol/L蔗糖)装载、玻璃化保护剂脱水、小滴玻璃化处理(将PVS2脱水处理过的植物材料放到无菌铝箔条内含PVS2液滴上)、液氮保存、化冻、洗涤、冻后培养等环节[11,26]。Yoon等[27]采用小滴玻璃化法研究了两个马铃薯品种(Dejima和STN13)超低温保存后母株继代培养和茎尖预培养的效果;继代培养条件(光照强度、通气量和种植密度)对两个品种的非超低温保存和超低温保存茎尖的存活都有显著影响;离体培养时间和茎尖位置对离体茎尖存活有显著影响(P＜0.000 1);Dejima和STN13的最适继代时间分别为7周和5周,最适茎尖大小分别为1.5～2.0 mm 和1.0～1.5 mm;冻存茎尖的存活率受预培养基中蔗糖浓度和预培养时间的影响;用摩尔浓度0.3 mol/L蔗糖预培养8 h,然后用摩尔浓度0.7 mol/L蔗糖预培养18 h,观察到低温保存茎尖的最高存活率,这些结果表明,母株继代培养和茎尖预培养的参数应谨慎优化。Kim 等[28]认为对于基因库来说,低温保存程序在广泛的基因型中的适用性是一个关键问题,从栽培和野生马铃薯品种中找出导致超低温保存茎尖存活差异的关键因素具有重要的现实意义;小滴玻璃化法是小滴冷冻和溶液玻璃化冷冻相结合的方法;PVS2脱水20 min后,将茎尖置于PVS2溶液滴在铝箔条上冷却,将箔条插入摩尔浓度0.8 mol/L蔗糖溶液(40 ℃下)中加热30 s,然后在摩尔浓度0.8 mol/L蔗糖中卸载30 min,冷冻后存活率高,该优化方案成功地应用于12份材料,存活率在64.0%～94.4%之间。Gallard等[29]通过优化加载液(LS)和植物玻璃化液2(PVS2)的时间,采用小滴玻璃化法对天竺葵茎尖进行超低温保存;将切除的茎尖分两步脱水(LS为20 min,PVS2为15 min),然后直接浸入液氮中;在室温下,在复苏液中解冻和卸载15 min后,在半固态的MS培养基上接入茎尖;这一简单的无须任何预处理的方法成功地应用于8个品种,成活率在55.6%～96.2%之间,再生率在9.1%～70.6%之间,这些结果证明了天竺葵种质资源超低温保存长期保存的可行性。Pinker等[30]采用小滴玻璃化法对草莓(Fragaria x ananassa DUCH.cvs.‘Senga Sengana’,‘Korona’and‘Aroma’)的茎尖进行了超低温保存;2～3 mm 长的茎尖在蔗糖(0.1,0.25,0.5,0.75,1.0 mol/L)培养基中预培养24 h和48 h,然后移入6滴PVS2玻璃化液中20 min,并浸入液氮中;在液体介质中室温快速复温;在所有品种中,用摩尔浓度0.25 mol/L蔗糖预培养24 h后恢复率最高(60%);在冻后恢复的茎尖中,并非所有的茎尖都继续发育和繁殖;田间观察到的脱落类型受蔗糖浓度的影响;在摩尔浓度0.1 mol/L蔗糖中预培养后,未观察到脱落类型,而在高蔗糖浓度中预培养后,脱落类型的数量在最高蔗糖浓度下高达20%。白建明等[31]对马铃薯茎尖小滴玻璃化法超低温保存进行了研究,结果表明,马铃薯茎尖在MS＋摩尔浓度0.3 mol/L蔗糖和MS＋摩尔浓度0.5 mol/L蔗糖的液体培养基中分别预培养1 d后,0℃下PVS2脱水30 min,然后转到铝箔条上约15μL的PVS2小滴中,最后投入液氮保存,存活率和再生率最高达79.91%和62.52%;通过SSR 分子标记检测,再生植株无遗传变异。Kim和Lee[32]认为尽管合适的超低温保存方案是基础研究和大规模实施以及进一步超低温保存研究的先决条件,但这一过程依赖于反复试验;在玻璃化法超低温保存技术中,小滴玻璃化法超低温保存具有较高的冷冻后回收率。然而,该程序本身不能解决植物超低温保存的问题,突出的问题是由于细胞毒性玻璃化溶液造成的脱水;建议用摩尔浓度0.3 mol/L蔗糖进行31 h的渐进式预培养,用摩尔浓度0.7 mol/L 蔗糖进行17 h的渐进式预培养,用玻璃化溶液C4－35%(质量浓度175 g/L甘油＋质量浓度175 g/L 蔗糖)加载20至40 min,在室温下用A3—90%(质量浓度375 g/L甘油＋质量浓度150 g/L二甲基亚砜＋质量浓度150 g/L乙二醇＋质量浓度225 g/L蔗糖)的玻璃化溶液脱水10—30 min或B1－体积分数100%(PVS3)脱水40～120 min,用铝箔条冷却样品,浸入预热(40 ℃)的卸载溶液(摩尔浓度0.8 mol/L 蔗糖)中再加热,然后根据材料的尺寸和渗透性,进一步卸载20 min至60 min;使用这种系统的方法,可识别材料是否耐受或敏感的化学毒性和渗透胁迫与玻璃化溶液脱水,从而揭示了在溶液为基础的玻璃化方法的主要障碍;根据样品的敏感性,可设计一个小滴玻璃化过程,即预培养、装载、玻璃化溶液脱水、冷冻和复温;利用这种方法,有助于制定合适的小滴玻璃化冷冻方案。Yin等[33]报道了一种简便易行、应用广泛的百合茎尖超低温保存方法;该方法以在芽再生培养基上培养4周叶段诱导的不定芽为试材;切取1.5～2 mm 长包括2～3叶原基的茎尖先在MS培养基上用摩尔浓度0.5 mol/L蔗糖预培养1 d,然后用含摩尔浓度0.4 mol/L蔗糖和摩尔浓度2 mol/L甘油的装载液装载20 min,然后在0 ℃下用PVS2脱水4 h;脱水的茎尖转移到铝箔条上的2.5μL PVS2液滴上;在含有摩尔浓度1.2 mol/L蔗糖的MS培养基中,在室温下将冷冻的茎尖复温20 min,然后进行解冻后培养可获得茎尖再生;使用简单序列重复标记进行的评估发现,这种百合液滴玻璃化冷冻保存方法高效、简便,可广泛适用于百合遗传资源的长期保存。李伦政等[11]认为在胚状体再生过程中的胚性细胞一般采用继代培养进行保存,容易造成遗传变异或种性退化,而小滴玻璃化法超低温保存能有效保持胚性细胞的遗传稳定性;4 ℃条件下,在摩尔浓度0.3、0.5、0.7 mol/L蔗糖培养基上预培养3 d的海岛棉XH33胚性细胞,再经过PVS2装载20 min和脱水20 min,细胞存活率高达55.55%;流式细胞术和SSR 分子标记结果表明,小滴玻璃化法超低温保存并未影响海岛棉XH33胚性细胞的遗传稳定性。

3 包埋玻璃化法超低温保存

包埋玻璃化法超低温保存(cryopreservation by encapsulation－vitrification)是将包埋法和玻璃化法结合起来进行液氮保存的方法。其基本程序是:预培养、包埋、装载(海藻酸钠和氯化钙凝胶系统)、PVS2脱水、液氮保存、化冻、洗涤、冻后培养等环节[34]。Matsumoto等[35]采用包埋玻璃化法对离体培养的芥末顶端分生组织进行了超低温保存,成活率达95%以上。Hirai等[36]以离体草莓(Fragaria×ananassa Duch.)为材料,采用玻璃化溶液对海藻酸钠包被的分生组织进行了超低温保存;在黑暗中,从4 ℃下低温锻炼的植株上切下的分生组织在两周内被包裹在含有摩尔浓度2 mol/L甘油和摩尔浓度0.4 mol/L蔗糖混合物的海藻酸钠凝胶珠中;这些被包裹和冷冻保护的分生组织在浸入液氮之前,用PVS2在0℃下脱水2 h;分生组织包埋玻璃化成功后,在未形成中间愈伤组织的情况下,在1周内,分生组织保持绿色,并发育出新梢;包埋玻璃化分生组织的平均成苗率接近90%;该方法在4个草莓品种上成功应用;还证实了冷却至－196℃的包埋玻璃化法分生组织比包埋脱水法分生组织更有利于芽的形成和分生组织的复苏;Hirai和Sakai[37]用包埋玻璃化法成功超低温保存了马铃薯(Solanum tuberosum L.)腋芽离体培养的分生组织,用摩尔浓度2 mol/L 甘油＋摩尔浓度0.6 mol/L蔗糖的混合物处理分生组织90 min;再用PVS 20 ℃下脱水3 h;冻后无愈伤组织形成;平均成苗率近70%;用17个引物对超低温保存和未处理的植株进行RAPD 分析,两者无遗传差异。该方法还证实了包埋玻璃化法超低温保存比包埋脱水法超低温保存有利于分生组织的芽形成。Tanaka等[38]采用玻璃化法和包埋玻璃化法成功地对不同龙胆品种(系)离体植株的茎尖进行了超低温保存;尽管这两种方案在液氮中储存后的存活率都很高,但与玻璃化方案相比,包埋玻璃化法方案有几个明显的优势:(i)在最佳条件下存活率更高;(ii)PVS2的最佳暴露时间范围更广;(iii)包埋玻璃化法超低温保存的茎尖再生明显更为旺盛和迅速。用这两种方法对10个龙胆属植物品种的茎尖进行了玻璃化法超低温和包埋玻璃化法超低温,平均存活率分别为49.0%和73.7%。这些结果表明,该研究所优化的两种方案对龙胆遗传资源的超低温保存具有广阔的应用前景。Gámez－Pastrana等[39]对菠萝茎尖的包埋玻璃化法超低温保存处理方法进行了一些改进;装载前茎尖在蔗糖－脯氨酸中的预生长显著缩短了成功超低温保存所需的PVS2 和PVS3的暴露时间;在0 ℃下用PVS3包埋和处理,在冷却前后存活率最高;最适条件是将菠萝根尖包埋在海藻酸钙(质量浓度30 g/L)中,然后用摩尔浓度0.16 mol/L蔗糖＋摩尔浓度0.3 mol/L脯氨酸和摩尔浓度0.3 mol/L蔗糖＋摩尔浓度0.3 mol/L 脯氨酸预培养分别进行预培养2 d 和24 h,室温下用摩尔浓度0.75 mol/L蔗糖＋摩尔浓度1 mol/L甘油装载液处理25 min,0℃下用PVS3脱水60 min,MD－2和Puerto Rico两品种的茎尖存活率分别为54%和83%。Wang等[40]采用包埋玻璃化法成功地保存了两个葡萄砧木:110 Ritcher(V.berlandieri×V.ruperstris)、41B(V.vinifera×V.berlandieri)和几个酿酒葡萄品种(Vitis vinifera)的悬浮胚性细胞,在蔗糖摩尔浓度为0.75 mol/L的情况下预培养,并在0 ℃下PVS2脱水270 min时,悬浮胚性细胞的存活率为42%～76%;生化分析表明,蔗糖预培养导致悬浮胚性细胞总可溶性蛋白和糖水平的变化;尽管冻后细胞的鲜重增加明显低于对照细胞,但在胚性细胞悬浮体系重新建立后,两次传代后冷后细胞和对照细胞的生长模式相同,是一套适用于不同葡萄品种的通用高效低温保存系统。娄汉平等[41]对树莓茎尖包埋玻璃化法超低温保存进行了研究,建立了简单、高效的树莓种质资源包埋玻璃化法超低温保存程序,成活率达85%。陈红和韩晓莹[42]以贵州特有的地方李资源——酥李为材料,建立和优化了其包埋玻璃化法超低温保存技术体系,茎尖存活率达21%。张玲等[43]研究了蔗糖、预培养及玻璃化保护液对胡杨休眠茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响;含有休眠茎尖的褐藻酸钙胶球在摩尔浓度0.8 mol/L蔗糖溶液中预培养24 h,经质量浓度400 g/L甘油＋质量浓度450 g/L 蔗糖＋质量浓度100 g/L 聚乙二醇(400 0)＋质量浓度50 g/L二甲基亚砜的玻璃化保护液室温下脱水30 min后,可以获得较好的存活率。许丹尔等[44]将包埋玻璃化法应用于苔藓植物的超低温保存也取得了成功;卵叶泥炭藓无菌苗4 ℃下预培养3 d,0 ℃下用体积分数60%PVS2装载30 min,PVS2脱水60 min,成活率可达42.4%,未发生遗传变异。

4 包埋脱水法超低温保存

包埋脱水法超低温保存(cryopreservation by encapsulation－dehydration)又称为包埋干燥法超低温保存,来源于人工种子的想法,不采用高浓度玻璃化保护剂脱水而是采用无菌风或硅胶脱水后进行液氮保存。其基本程序包括预培养、包埋(海藻酸钠和氯化钙凝胶系统)、热吹风脱水或硅胶脱水、液氮保存、化冻、冻后培养等环节[45]。Paulet等[46]建立了甘蔗离体试管苗茎尖的包埋脱水法超低温保存方法;茎尖分离后,在标准培养基上培养1 d,然后用质量浓度30 g/L海藻酸钠包埋;最佳条件为:在摩尔浓度0.73 mol/L蔗糖的液体培养基中预培养2 d,在层流下干燥6 h,或在硅胶中干燥10～11 h,然后快速冷冻和缓慢解冻;5个供试品种在液氮中冷冻后的存活率在38%～91%之间;包埋脱水法超低温保存并没有改变植物的氨基亮氨酸肽酶和淀粉酶的电泳图谱。Bachiri等[47]采用海藻酸钠微珠包埋技术对长春花细胞悬液进行超低温保存;微囊化细胞在蔗糖强化培养基中预培养数天,硅胶干燥,液氮直接冷却;室温空气复温后,将海藻酸钠微珠置于半固态培养基上;再生后转移到液体培养基中的珠子产生了一种新的细胞悬浮液;冻存微囊细胞的存活和再生取决于预培养时间和空气干燥后的残余水分含量。Sakai等[48]提出了一种简单有效的植物超低温保存的包埋脱水方案,该方案是玻璃化与包埋脱水的折中方案,与传统的包埋脱水法相比,该方法缩短了超低温保存程序所需的时间,并在三种被测植物(芥末、菊花和薄荷)中产生了更高的恢复生长率。Gonzalez－Arnao和Engelmann[49]认为包埋脱水是在人工种子生产技术的基础上发展起来的一种超低温保存技术,即外植体包埋在海藻酸钙珠中;包裹的外植体在高蔗糖浓度的液体培养基中进行预培养,并在冷冻前部分干燥;对外植体进行包埋可以使后续的处理非常剧烈,包括高糖浓度的预培养和低含水量的干燥,这将对未包埋的样品造成严重损害或致命,以甘蔗茎尖为例,一种包括预处理、包封、预培养、干燥、冷冻和贮存、解冻和再生等步骤的包埋脱水方案已进行优化并成功应用于约40种不同植物。Wood等[50]用海藻酸钠珠包埋兰花种子。在摩尔浓度0.75 mol/L的最佳浓度下用蔗糖预处理18 h,降低了无菌空气流[23 ℃,相对湿度30%RH(Relative Humidity)]中的干燥速率,并在长达16 h的干燥后提高了种子的存活率;将预处理和16 h干燥的珠子转移到冷冻小瓶中,随后在低温范围内保存30 d;当珠子预干燥至约20%的水分含量时,在－196 ℃下保存1 d不会对兰花的胚胎生长产生不利影响,并提出超低温有可能作为不同分类群的保存工具。Wang等[51]采用包埋脱水法成功地将葡萄胚性细胞悬浮液超低温保存并实现了植株再生。当包埋的细胞脱水至20.6%的含水量并在摩尔浓度1 mol/L蔗糖上进行2～4 d的预培养时,超低温保存的细胞获得了最佳的存活率,并发现含质量浓度2.5 g/L AC的MGN 固体培养基能提高冻后细胞的活力;尽管冷冻保存的细胞在再生过程中表现出5d的滞后期,其鲜重的增加仅为对照细胞的一半,但在细胞悬浮液中重新建立后,其生长模式与两次传代后的对照细胞相同;与对照和脱水处理相比,超低温保存促进了胚胎发生和随后的植物萌发;从低温保存的细胞中再生的植株叶片形态与从对照细胞中再生的植株相似。González－Arnao等[52]采用包埋脱水技术对柑橘不同基因型的胚珠和体细胞胚进行了超低温保存。在含摩尔浓度0.75 mol/L、摩尔浓度1 mol/L或摩尔浓度1.25 mol/L蔗糖的液体培养基中,不同的预培养条件下,低温保存胚珠的存活率是不稳定的;建立了两种胚性来源(胚珠和柱头、花柱和子房的薄层外植体)体细胞胚的高效低温保存方法,可获得较高的存活率(75%～100%);组织学研究表明,经过包埋脱水处理的胚胎,体内积累了大量的蔗糖,保证了超低温保存后整个胚胎的恢复。Clavero－Ramírez等[53]介绍了几种草莓基因型茎尖包埋脱水法超低温保存方法的研究结果,茎尖包裹在海藻酸钠凝胶中,在含有高浓度蔗糖(摩尔浓度0.8 mol/L,常规方案)或摩尔浓度0.4 mol/L蔗糖和摩尔浓度2 mol/L甘油组合的培养基上预培养,不同基因型的成活率不同(23%～63%);摩尔浓度0.4 mol/L蔗糖和摩尔浓度2 mol/L甘油组合预培养大大缩短了超低温程序所需的时间。

5 展望

超低温保存技术是植物离体保存技术中最为重要的技术之一,与传统的生境保存和非生境保存相比,可节约大量的物力、财力和人力,还可避免遭受外界环境的破坏,具有很强的实际应用性[54]。目前,常用的超低温保存方法主要包括玻璃化法、包埋脱水法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法等方法。玻璃化法超低温保存,由于保护剂浓度高,对材料毒害作用较大,对脱水过程和保护剂渗透性需严格控制,且同一时间处理材料有限;包埋脱水法超低温保存一般利用海藻酸钙将材料包埋后放置高浓度蔗糖培养基中预培养,利用无菌空气流脱水,投入液氮中贮存的包埋脱水法,弥补了玻璃化法的不足,但相对玻璃化法脱水时间长、组织恢复生长慢、部分植物材料成苗率低;包埋玻璃化法超低温保存是在包埋脱水法和玻璃化法的基础上发展出来的,将材料放入氯化钙和海藻酸钠组成的包埋液形成小球后置于玻璃化溶液中脱水,然后投入液氮保存,该方法存活率高,脱水时间短,材料恢复生长较快,方法简便易操作;小滴玻璃化法超低温保存是一种相对较新的方法,即材料经预培养后用装载液和玻璃化液对材料进行处理,随后将材料转入滴有PVS2 铝箔条上形成小滴,再将铝箔条放入装有液氮的冷冻管中,然后液氮保存,该方法具有存活率、再生率高、适用性广、处理量大、操作简单等特点。在进行植物种质资源超低温保存时,可根据自己的实验室条件和实际需求,对上述4种超低温保存方法进行合适的选择,以达到植物种质资源长期保存的预期效果。