基于1HNMR法对丹红注射液干预自发高血压大鼠尿液代谢物的特征分析

吴桂霞，蒋 睿，李 静，李俊红，雷冬玉，蒋 萍

（新疆医科大学1基础医学院生理学教研室，乌鲁木齐830011；2第六附属医院内镜诊治科，乌鲁木齐830002）

原发性高血压是以主动脉血压自发性升高为特征，并伴有不同程度器官损伤的疾病综合症，是心脑血管疾病发病和死亡最重要的危险因素[1]。中医理论认为血瘀证是高血压病的独立证型或兼证，活血化瘀治疗高血压病已在临床上得到认可[2-3]。丹红注射液为丹参和红花提取物的中药制剂，具有扩张血管、降低外周血管阻力、扩张冠状动脉和改善心肌血供等药理作用，多用于高血压及心血管疾病的治疗[4-7]。在控制血压的同时兼顾器官功能损伤的改善，具有多靶点综合干预的优势[8-10]。自发高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是将Wistar大鼠中血压稍高于平均水平的雌性和雄性大鼠交配，进行近交筛选和维持所得到的新品系大鼠。在出生后4～6周龄，无任何应激刺激（物理、药物、手术等因素）条件下自发形成高血压，该模型与人类原发性高血压病理生理过程相似，是常用的高血压病动物模型。本研究采用1H 核磁共振（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）代谢组技术分析丹红注射液干预后，SHR 大鼠尿液中代谢物的变化，筛选有差异的代谢物，经生物信息分析技术找寻产生这些代谢物的相关代谢通路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器MPA型无创血压测量分析系统(上海奥尔科特生物技术有限公司)，低温超高速离心机(德国Eppendorf 公司)，600 MHz 磁共振波谱仪及工作站（美国Varian 公司），BSA124S型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试剂丹红注射液（菏泽步长制药有限公司，批号：14102021），K2HPO4·3H2O、NaH2PO4·2H2O（天津市光复精细化工研究所，批号：160808，171202），D2O（美国cambridge Isotop Laboratories 公司，批号：7789-20-0）。

1.3 实验动物SPF 级12 周龄雄性SHR 大鼠、雄性Wister- Kyoto（WKY）大鼠，体质量（130±10）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2013-0001]。

1.4 分组及给药方法将14 只SHR 大鼠随机分为2组：自发性高血压组（SHR 组），丹红注射液干预组（DH 组），另取7 只WKY 大鼠为正常对照组（WKY组）。DH组腹腔注射丹红注射液（10 mL/kg体质量），SHR 组和WKY 组腹腔注射同等剂量无菌生理盐水，各组连续给药28 d。

1.5 指标的测定

1.5.1 1HNMR法尿液代谢物的测定 给药结束后，各组大鼠尾动脉无创测定血压、心率，代谢笼收集各组大鼠24 h 内尿液，每个样本取尿液400 μL，加入200 μL含0.05%3-（甲基硅基）氘代丙酸钠的磷酸盐缓冲液，室温放置10 min，10 000 r/min 离心10 min，取550 μL 上清液放入5 mm 核磁管，Inova 600 兆核磁共振波谱仪调用Noesy-presat-1D脉冲序列测定氢谱。

1.5.2 1HNMR 图谱处理及数据分析 调整尿液氢谱基线及相位，对氢10.0 ～0.5 ppm 区域进行积分，积分值行归一化处理。

1.5.3 代谢通路分析 采用生物信息学分析方法，在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 数据库检索代谢物所涉及的代谢通路。

1.6 统计学处理采用SIMCA-P+11（Umetrics Inc.，Umea ，Sweden）软件进行主成分分析（principal component analysis, PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis,PLS-DA），正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）。以代谢物Pearson相关系数确定各组的差异代谢成分，基于Pearson 相关系数显著性差异检测确定相关系数的显著性阈值，相关系数|r|＞0.666（最小样本数为7），|r|值越大表示差异性越大，反之越小，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 1HNMR 法尿液代谢物成分的PCA 及OPLSDA 分析大鼠尿液代谢物的成分，在SHR 组与WKY 组（R2X=0.902，Q2=0.781）、SHR 组与DH 组（R2X=0.954，Q2=0.907）组间有分离趋势，见图1。大鼠尿液代谢物的成分，在SHR 组与WKY 组（R2X：0.921，R2X：0.992，Q2：0.934）、SHR 组与DH 组（R2X：0.938，R2X：0.993，Q2：0.966）组间明显分开，且无交叉和重叠，组间尿液代谢成分存在差异，见图2。

图1 基于1H NMR的主成分分析图

图2 基于1H NMR的正交偏最小二乘判别分析图

2.2 差异代谢物分析以各组间尿液中代谢物Pearson相关系数确定各组的差异代谢成分，与WKY组相比较，SHR 组尿液中乙酸（Acetate）、N-乙酰糖蛋白（NAC，N-acetylglycoproteins）、柠檬酸盐（Citrate）、α-葡萄糖（α-Glucose）、胍基乙酸（Guanidinoacetic acid）、组氨酸（Histidine）、苯基乙酰甘氨酸（Phenylacetylglycine）、赖氨酸（Lysine）、马尿酸（Hippuric acid）含量降低，牛磺酸（Taurine）含量升高；DH 组与SHR组比较，乙酸、N-乙酰糖蛋白、柠檬酸盐、α-葡萄糖、胍基乙酸、组氨酸、苯基乙酰甘氨酸、赖氨酸、马尿酸含量升高，牛磺酸（Taurine）含量降低，见表1。

2.3 代谢通路分析将代谢标记物输入KEGG 数据库，差异代谢物葡萄糖、L-苏氨酸、乳酸、组氨酸、肌酐、马尿酸、柠檬酸盐与糖酵、解糖异生、氨基酸代谢、三羧酸循环等代谢通路有关，见表2。

表1 尿液中差异代谢物的成分分析

表2 尿液代谢物所涉及的代谢途径

3 讨论

代谢组学通过对机体内生性代谢物变化的分析，为中药多效性机制研究提供高分辨、多因素的表型识别特征[11]。本研究共筛选出差异代谢物11 个，经KEGG 分析发现，这些差异代谢物涉及到糖酵解糖异生、磷酸戊糖途径糖代谢、组氨酸代谢、精氨酸、三羧酸循环等代谢通路，均与物质代谢和能量代谢相关，说明丹红注射液可通过干预糖、蛋白质、脂类的代谢改善高血压患者的内环境。与SHR 组比较，WKY 组大鼠尿液中柠檬酸盐、α-酮戊二酸、赖氨酸、胍基乙酸含量降低，牛磺酸含量升高。丹红注射液干预后，DH 组大鼠尿液中上述代谢物含量被逆转，提示丹红可能通过调控SHR 大鼠的代谢通路，干预尿液代谢物的排出。柠檬酸盐、α-酮戊二酸是三羧酸循环中的关键物质，赖氨酸为生酮氨基酸，可被分解为葡萄糖或酮体提供能量。柠檬酸盐、α-酮戊二酸以及赖氨酸在尿液中含量降低，提示SHR 大鼠高能耗消耗状态，为给机体供给更多能量，三羧酸循环和赖氨酸分解处于较高水平。丹红注射液干预后，DH 组大鼠尿液中上述三种代谢物含量升高，提示丹红有可能通过干预三羧酸循环以及赖氨酸代谢，改善SHR 大鼠能量紊乱的状况[12]。胍基乙酸是甘氨酸代谢的中间产物，肌酸的前体物质，在生成肌酸的过程中会提高半胱氨酸的水平，而高半胱氨酸是动脉粥样硬化发病的独立危险因子[14]。牛磺酸为含硫半必需氨基酸，能激活鸟苷酸环化酶使血管平滑肌细胞环磷酸腺苷浓度升高，经NO/cGMP 通路增加尿钠排出；还能抑制血管紧张素转换酶，降低血管紧张素II 的生成，扩血管，促进钠水排出，降低动脉血压[15]，为心血管保护物质。本研究中，与SHR 组比较，DH组大鼠尿液中胍基乙酸含量增加，牛磺酸含量减少，提示丹红有可能通过增加胍基乙酸、减少牛磺酸的排泄保护心血管。

综上所述，对SHR 大鼠所进行的1HNMR 代谢组学的结果显示其存在能量代谢、糖代谢和氨基酸代谢紊乱。丹红注射液干预可增加乙酸、N-乙酰糖蛋白、柠檬酸盐、α-葡萄糖、胍基乙酸、组氨酸、苯基乙酰甘氨酸、赖氨酸、马尿酸的排泄，改善SHR 大鼠的代谢紊乱，减轻高血压损伤，在具体的代谢途径中的作用还有待进一步深入探讨。