中药质量评价关键问题与分析方法探讨

王 帅，包永睿，李天娇，杨欣欣，孟宪生*

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 116600)

中药质量是保障药品安全有效、稳定可控的基础。同样，中药的质量控制问题一直是制约我国中医药现代化发展的热点与难点问题。我国现行的中药质量评价模式与控制体系主要以发达国家对化学药品的质量控制为借鉴。然而，化学药品成分单一、疗效与机制明确，对于含有成百上千种化学成分的单味中药乃至中药复方而言，该体系并不完全适用。在科技手段进步与发展的同时，人们对中药质量检测方法与手段的探索与革新也从未停止。以具有法定标准效力的《中国药典》为例，从1953年至今已颁布11版，在薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等常规检测方法的基础上，进一步扩大了对新技术、新方法的应用，将液相色谱-串联质谱法、分子生物学检测技术、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法等用于中药的质量控制，以提高检测的灵敏度、专属性和稳定性，加强对用药安全性和有效性的保障。

质控方法是手段，保障疗效是目的，“找到有效成分”、“合理控制有效成分含量”是中药质量检测的关键所在，是保障疗效的核心问题。为此，多年来广大科研工作者做出了许多有益的探索，本文主要围绕“发现”与“控制”有效成分的中药质量评价方法进行探讨，为丰富和完善中药质量控制方法，以及中药质量标准体系的提升提供借鉴。

1 中药“谱-效”关系研究

中药谱效学的概念最早于2002年由李戎等提出[1]。它是指在中医理论指导下，将中药指纹图谱和药效学通过化学计量学模型进行关联，建立以化学分析与生物活性评价相结合的综合评价体系[2]。笔者统计了2002年1月～2020年9月CNKI中文期刊收录的中药“谱-效”关系研究相关文献，发现文章数量呈逐年上升趋势(见图1)。经过近20年的实践与发展，中药谱效学在质量控制方面，为中药活性成分的筛选与质控指标的选择提供了重要的参考依据。

中药“谱-效”关系研究的目标是寻找中药化学成分差异与药效差异的对应关系。指纹图谱的建立、药效学评价及将二者相关联的数据分析技术是中药“谱-效”关系研究的3大基本要素(图2)。

图2 中药谱效关系研究要素与方法Fig.2 Research elements and methods of the relationship between spectrum and effect of traditional Chinese medicine

1.1 指纹图谱的建立

通常采用高效液相色谱法、气相色谱法、液相/气相色谱与质谱联用法或红外光谱法等检测手段，针对不同产地、不同采收期、不同提取工艺或不同批次(即含有变量)的中药/中药复方，建立相应指纹图谱。其中高效液相色谱法(HPLC)是应用最为广泛的方法，质谱方法常用于进一步的化学成分表征。王莹等[3]利用HPLC建立了15批芍药甘草汤煎液的指纹图谱，探讨了芍药甘草汤物质组分对癫痫小鼠脑组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)酶水平影响的谱效关系，筛选出芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷等对MDA、SOD和ATP的酶活性影响有贡献的成分。吕婧等[4]采用液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF MS/MS)建立了20批不同产地西洋参皂苷类成分的指纹图谱，研究了西洋参皂苷类成分指纹图谱与其增强免疫力作用的谱效关系，结果在标定的22个共有峰中，筛选出6个与增强免疫活性具有显著相关性的成分。许平翠等[5]采用气相色谱-质谱(GC-MS)建立了15批不同产地白术饮片挥发油的指纹图谱，并研究了该指纹图谱与抗氧化活性的相关性，分别筛选出挥发油清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基活性最强的5个成分和还原Fe3+能力最强的5个成分，证明了苍术酮是白术主要的抗氧化活性物质。此外，基于血清药物化学理论，即“多数成分在发挥疗效时首先要被人体吸收”理论，窦志华课题组[6]于2007年提出了中药血清谱效学概念，将中药“谱-效”关系研究提升到生物表达层面，丰富了谱效理论的研究内容[7]。窦志华等[8]通过将SD大鼠灌胃制备茵陈蒿汤及其各单味药、各缺味方含药血清，建立了不同方剂配伍组含药血清的HPLC指纹图谱，同时评价了不同方剂配伍含药血清的保肝作用药效，并寻找指纹图谱中与药效相关的色谱峰，结果发现来源于大黄的蒽醌类成分及体内代谢产物、来源于栀子的环烯醚萜类成分及体内代谢产物和西红花酸类成分体内代谢产物是茵陈蒿汤保肝作用的药效物质，其中1个蒽醌类成分体内代谢产物活性较强。

1.2 药效学评价

在药效学评价方面，对于整体动物、组织器官、细胞水平、分子水平4个研究层次均有文献报道。涉及抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗溃疡、抗氧化、保肝、免疫调节、促胃肠动力、补肾等诸多药理活性。张希等[9]基于经典名方五子衍宗丸的补肾益精作用，考察了不同批次五子衍宗丸提取物对雷公藤多苷致肾精亏虚证大鼠卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)、一氧化氮(NO)水平的影响，经谱效关系研究发现五子衍宗丸补肾涩精药效成分主要集中在水饱和正丁醇部位，对药效贡献最大的为绿原酸，其次为槲皮素。何前松等[10]研究了疏毛吴茱萸提取物指纹图谱特征峰所代表的化学成分与缓解家兔离体肠平滑肌痉挛的相关性，筛选出主要活性物质可能为吴茱萸碱、吴茱萸次碱、绿原酸及其异构体、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、去氢吴茱萸碱、14-甲酰基二氢吴茱萸次碱和柠檬苦素。樊佳新等[11]采用HPLC法建立了9种不同产地荆芥药材乙醇提取物的指纹图谱，并基于微流控芯片技术评价了不同产地荆芥药材乙醇提取物诱导人肺癌A549细胞凋亡的抗肿瘤药效，寻找二者之间的相关性，结果证明荆芥中发挥抗肺肿瘤作用的主要化学成分为香叶木素、木犀草苷、木犀草素、橙皮苷、芹菜素等。马宁宁等[12]利用UPLC-Q-TOF MS建立了延胡索不同提取物的指纹图谱，以核转录因子-κB(NF-κB)荧光素酶为标志物对人体支气管上皮细胞进行抗炎活性实验，证明了黄连碱、小檗碱、巴马汀、二氢血根碱和去氢紫堇碱是延胡索发挥抗炎作用的主要有效成分，并进一步结合分子对接技术推测延胡索通过作用于蛋白激酶C(PKC)、细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)、抑制蛋白激酶β(IKKβ)、Janus激酶1(JAK1)、磷脂酰肌醇-3-激酶α(PI3K-α)、磷脂酰肌醇-3-激酶γ(PI3K-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)影响炎症信号的传递。

1.3 数据分析技术

数据分析技术是建立谱效关系的重要组成要素。目前文献报道的方法有相关分析(包括双变量相关分析、多元相关分析、典型相关分析等)、回归分析(包括多元线性回归、偏最小二乘回归等)、灰色关联度分析、主成分分析、聚类分析、人工神经网络等。吕邵娃等[13]根据实验目的不同，将上述数据分析技术归为预测各成分与药效间关联度、阐明各成分对药效贡献率和简化数据结构寻找主要活性成分3类。不同的数据处理方法，对中药有效成分的筛选结果往往存在一定差异，应根据具体实验目的、方法以及适用范围选择适宜的分析方法。

主成分分析、典型相关分析属于简化数据结构的方法，是初步判断化学成分对药效贡献大小的方法，在谱效关系研究中常与其他方法联合使用。黄艳菲等[14]开展了基于谱效关系的藏药材全缘叶绿绒蒿全草(非花入药部位)抗氧化质量标志物研究，首先采用主成分分析法对总抗氧化能力、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和抑制超氧阴离子自由基能力4项具有相关性的活性评价指标进行降维处理，筛选出能最大程度反映抗氧化活性的指标—DPPH自由基清除能力，并以其为代表进行后续实验，结合灰色关联度分析最终从29个共有峰中确认槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-[2′′-O-乙酰基-β-D-半乳糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]为全缘叶绿绒蒿全草的质量标志物。张华锋等[15]开展了基于聚类分析和典型相关分析的北柴胡保肝作用谱效关系研究，建立10批次柴胡皂苷的HPLC指纹图谱后，进行系统聚类分析将药材按总皂苷质量分数分为4类，进而采用变量聚类分析法寻找指纹图谱共有峰中各元素间的亲疏关系。结果发现柴胡皂苷a和柴胡皂苷d聚为一类；将HPLC指纹图谱共有峰和样本间的药效结果均数作为共同变量进行聚类分析，发现药效指标谷丙转氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)与柴胡皂苷a、柴胡皂苷d具有较高的相关性，进一步的典型相关分析也证明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d为北柴胡保肝作用的部分药效物质基础。

灰色关联度分析法、人工神经网络、双变量相关分析法是预测各成分与药效间关联度的分析方法。其中灰色关联度分析法的相关文献报道较多，适用于样本信息量单一、影响因素较复杂的图谱。黄潇等[16]运用灰色关联度分析法，开展了栀子提取物抗炎作用谱效关系研究，在对原始数据进行无量纲化处理后，以足肿胀度作为药效评价指标，根据各色谱峰与药效间的关联系数，筛选出对抗炎作用药效贡献排名前5的色谱峰，并鉴定出栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷2种成分。再分别以一氧化氮(NO)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)4种炎症因子为指标，进行灰色关联处理，进一步证明了这5种成分的抗炎作用。人工神经网络对于成分与药效之间存在的非线性关系具备较好的预测能力，马雯芳等[17]开展了基于BP人工神经网络分析滇桂艾纳香止血作用的谱效关系研究，首先采用灰色关联度法得到20批不同产地滇桂艾纳香药材指纹图谱中13个共有峰与凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)3个止血药效指标的关联系数，找到与止血作用密切相关的色谱峰。再通过BP人工神经网络MATLAB软件建立谱效关系模型，运用神经网络模型预测综合药效值，其相对误差的绝对值均小于或等于13.6%，大部分数值的相对误差小于7.0%。在质量控制过程中，可通过输入指纹图谱信息对其止血作用进行质量评价。

偏最小二乘回归分析法和多元线性回归法能够阐明各化学成分对药效的贡献率。其中偏最小二乘回归分析法是一种融合了多因变量对多自变量的回归建模以及主成分分析在内的多元数据分析方法[13]，可用于样本数小于变量个数的数据分析，是目前中药谱效关系研究中广泛应用并广为认可的方法。卞振华等[18]基于偏最小二乘回归法开展了五味子抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)活性部位谱效关系研究，以特征指纹图谱中代表化学成分各峰的峰面积为自变量X，五味子抗MRSA活性部位的抑菌系数为因变量Y，进行偏最小二乘回归分析，通过回归系数得到各特征峰的贡献大小，筛选出柠檬酸、苹果酸异构体为五味子抗MRSA的活性物质。为了满足不同的实验目的和验证活性成分筛选的准确性，多种化学模式识别方法的综合运用趋势明显。王帅等[19]采用灰色关联度分析结合偏最小二乘回归法，建立了朝鲜天南星、东北天南星与其抗肝肿瘤之间谱效关系，发现通过谱效学筛选出的活性成分相似，并探讨了朝鲜天南星作为地方习用品的合理性。徐硕等[20]分别采用灰色关联度分析法和双变量相关性分析法，建立了罗布麻叶指纹图谱与其体外抗氧化活性的谱效关系，两种方法所得结果基本一致，并筛选出绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和山柰酚为罗布麻叶抗氧化作用的活性物质。

1.4 “谱-效”色卡可视化质量评价技术

虽然近年来中药“谱-效”关系研究理论发展迅速，但在中药质量评价的实际推广应用方面仍存在一些问题。如多数中药“谱-效”关系研究在药效学评价时，仅针对某一特定药效展开研究，而中药多成分、多靶点、多途径的特性以及方剂配伍的影响，决定了其药理活性、功能主治的非单一性，使得“谱-效”关系研究筛选出的有效成分往往仅具有参考价值，而不能成为法定质量控制指标，从而限制了其实际应用。同时，科研应以服务社会为目的，尤其是中药质量评价体系的建立，既要考虑保障临床疗效安全、稳定的“高标准、严要求”，又要顾及药品生产企业“低成本、低投入”的实际需求。为此，笔者课题组结合多年研究经验，以典型中药大品种气滞胃痛颗粒复方质量评价体系的建立为例，首次开发了“谱-效”色卡可视化质量评价技术[21]，探索中药“谱-效”关系研究在中药质量控制方面的实际应用。

图3 “谱-效”色卡软件可视化界面Fig.3 Visual interface of spectrum effect color card software

气滞胃痛颗粒复方由柴胡、延胡索(炙)、枳壳、香附(炙)、白芍、炙甘草6味药材组成，成分涉及黄酮类、生物碱类、皂苷类、三萜类等不同性质的化学物质组，具有促胃肠动力、抗炎镇痛、抗溃疡多重功效。笔者课题组采用HPLC法建立了不同药材配伍组气滞胃痛颗粒指纹图谱，分别以大鼠原代小肠平滑肌细胞、RAW264.7小鼠单核巨噬细胞、GES-1人胃粘膜上皮细胞构建3种体外药效模型，获得不同配伍组药理活性参数，采用灰色关联度分析、人工神经网络方法分别构建三者的谱效关系[22-24]。结果发现发挥不同功效的活性成分之间既存在一定相似性，又有所区别。如发挥促胃肠动力作用的活性成分有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷等，主要来自枳壳药材；发挥抗炎作用的活性成分有甘草苷、芸香柚皮苷、柴胡皂苷A、异甘草素、没食子酸、甘草酸单铵盐、芍药苷、芍药内酯苷等，主要来自白芍、甘草等药材；发挥抗胃溃疡作用的活性成分有没食子酸、甘草苷、甘草酸单铵盐、芍药苷、异甘草素、橙皮苷等，主要来自甘草等药材[21]。在此基础上，采用Visual Basic(VB)编程语言，设计开发了“谱-效”色卡软件，采用体外药效模型获得的成分-药效关系数据进行软件程序校正与阈值设置，将企业实际生产出的不同批次气滞胃痛颗粒指纹图谱数据导入软件系统，可实现该批次产品促胃肠动力、抗炎镇痛、抗溃疡作用的单一药理活性和综合活性预测。经体内动物实验验证，“色卡”软件输出结果与其药效结果趋势一致。该研究实现了简单导入指纹图谱即可预测药效的中药质量可视化(图3)，对于企业实现“高标准、低投入”的中药质量控制需求具有更为现实的意义。另外，此方法建立的中药“谱-效”色卡综合考虑了各成分间相互作用的药效结果，经体内整体动物实验验证后，可逆向推断药效物质基础筛选的正确性与合理性，从而避免了谱-效关系研究产生的假阳性结果。

2 全时段等基线多波长覆盖融合指纹图谱

中药的质量控制正在由单一指标向多指标含量测定、定性与定量相结合的趋势发展。中药指纹图谱凭借其整体性的特点，结合多指标含量测定，能够满足上述质量控制要求。然而，中药复杂物质体系中存在不同的化合物类别，其最大吸收波长存在差异，单一波长图谱有时并不能全面反映化合物整体信息。为此，笔者课题组通过对红花、丹参、川芎、甘草、余甘子、蛇床子、木蝴蝶等中药材，及气滞胃痛颗粒、大川芎片、复方木鸡颗粒等中药复方的多年实践[25-27]，丰富、发展了多波长融合指纹图谱技术，提出“全时段等基线多波长覆盖融合指纹图谱技术”。该技术将现代分析检测手段和信息处理手段结合，在保证基线稳定不变的条件下，有效融合中药多种指标成分的谱图信息，并对其进行含量测定。所测成分均在最大紫外吸收波长下检测，可以克服单一波长检测时由于检测限高带来的定量不准、信息量不足等缺点，从而可较完善地反映中药的内在质量。如针对不同批次气滞胃痛颗粒，选择230、254、283 nm 3个波长，Matlab软件程序设计，建立了含有23个共有峰的多波长融合指纹图谱，同时对其中来自不同药材、发挥不同药理作用的白芍药苷、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸盐6种指标性成分进行了多指标成分含量测定[28]。该方法稳定、可靠，能够对气滞胃痛颗粒复方进行全面质量控制。另外，将该技术与“一测多评”等评价方法相结合[29]，在全面、系统控制中药质量的同时还可以节约对照品，降低检测成本，为合理的中药质量控制提供借鉴。

3 生物活性测定法

生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，可达到控制药品质量的作用[30]。该方法将复杂的中药活性成分作为“黑箱”，直接以药效为切入点评价药材质量，逐渐受到中国、美国等国家的重视与认可[31]。2010年版《中国药典》发布了《中药生物活性测定指导原则》，首次明确将中药的生物活性评价方法作为中药质量控制的具体原则。该方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法，应用时应优先选用生物效价测定法，对于不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法。《药典》中采用凝血酶滴定的方法测定水蛭药材抗凝血活性，用于水蛭药材的质量控制。谢晓华[32]以妇科千金片处方中具有抗菌作用的单面针和穿心莲2味药材为指标，考察了它们的单煎混合液对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌4种标准菌株的抑菌作用，并根据建立的量效曲线测定了不同批号妇科千金片的生物效价。张莉华等[33]基于活血化瘀药物多数具有的抗血小板聚集的作用机制，以中药活性成分丹酚酸B作为标准物质，建立了家兔体外抗血小板聚集生物效价检测方法，经第三方实验室验证重现性良好。

生物活性测定法用于中药质量评价起步较晚，仍存在某些问题有待解决，如中药所含化学成分复杂，寻找与待测样品一致或活性相似的对照品具有一定难度，目前尚缺少生物测定用中药标准品[34]；对于存在多种适应症的中药，需对每种适应症分别建立相应的生物活性检测方法；目前的生物活性仅涉及抗菌、抗凝血、抗炎等相对简单的药理活性，对于大部分复杂的中医功效尚缺少公认的药理评价模型等。但对于功能主治明确，有效成分模糊，检测方法不完善的中药，生物活性检测方法能够为其质量控制起到一定的补充作用。

4 展 望

中药质量问题是限制中医药现代化、国家化发展的关键科学问题之一，完善中药质量评价方法一直受到国家及广大科研工作者的重视与广泛关注。保障药材质量是保障中药疗效的根本，而“寻找”与合理“控制”中药有效成分又是中药质量检测的关键。中药“谱-效”关系研究方法是“发现”有效成分的有力手段，多波长融合指纹图谱为合理“控制”有效成分提供了良好的检测方法，而生物活性测定法则将中药化学成分看作整体，从药理活性角度入手建立评价方法，为丰富、发展中药质量评价体系提供了良好借鉴。在以上基础上，进一步开展中药质量评价及分析方法的研究工作尚有赖于广大科研工作者不断探索、创新和努力。