基于酶辅助靶标循环的适体传感器灵敏检测中药中黄曲霉毒素B1

吴 昊，吴 军，王洪勇，刘娅灵，韩国庆， 李文超，施青云，邹 霈,2*

(1.国家卫健委核医学重点实验室 江苏省分子核医学重点实验室 江苏省原子医学研究所，江苏 无锡 214063；2.南京医科大学 药学院，江苏 南京 211166)

黄曲霉毒素(AFT)是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的带有双呋喃环和香豆素结构的毒素[1]，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，是目前已知致癌性最强的天然毒素[2]，1993年被国际癌症研究机构(IARC)划定为1类致癌物[3]。中药材在生产、加工、贮藏、运输等过程中，受温度或湿度的变化极易发生霉变而污染黄曲霉毒素。《中国药典》2020版收载了24种中药材中黄曲霉毒素残留的限量检测，规定其中AFB1的含量不得高于5 μg/kg。通过文献调研发现中药材或中药饮片中受黄曲霉毒素污染的情况十分普遍。杨美华等[4]检测了14种中药材的29批样品，发现被AFB1污染的有12批，含量最高达32.18 μg/kg。沈紧治等[5]对35种中药饮片中AFB1的含量进行测定，结果有17种中药饮片被AFB1污染。赵祥升等[6]整理并分析了2000年以来中药中AFB1检测呈阳性结果的文献，统计显示149种中药的1 168批样品中检出AFB1，阳性样品超标率达52.40%。

目前，黄曲霉毒素的检测方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS)[9]等。这些方法定量准确、灵敏度高、抗干扰性强，但成本高昂、操作繁琐、费时耗力，不利于中药中黄曲霉毒素的快速检测，难以普及[10]。近年新发展起来的核酸信号放大技术，无论在仪器要求还是实际操作方面，均比传统检测技术有了长足的进步，不仅摆脱了对精良设备的依赖，操作上也更为简单方便。酶辅助靶标循环信号放大技术是基于核酸内切酶/核酸外切酶水解方式的差异性与核酸适配体技术、酶切循环效应、纳米技术、荧光标记技术等相结合，发展而成的一种等温核酸信号放大技术[11]。它具有反应条件温和、信号放大效率高、能在恒温条件下进行等优点。酶辅助靶标循环信号放大技术结合荧光[12]、比色[13]、化学发光[14]和电化学发光[15]等检测技术可以实现生物分子的高灵敏检测。

G-四链体/氯化血红素DNA酶是一种由富含鸟嘌呤碱基G的核酸四链体和氯化血红素(Hemin)形成的生物催化DNA酶[16]。它具有类似辣根过氧化物酶(HRP)的活性，可以在氯化血红素作用下催化H2O2介导的多种底物的氧化，如3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)[17]。与其他DNA酶或蛋白酶相比，G-四链体/氯化血红素DNA酶因具有制备成本较低、不易水解、易于修饰以及热稳定性较高等明显优势[18]，被广泛用于核酸[19]、蛋白质[20]、金属离子[21]和小分子[22]的高灵敏检测。

本文结合酶辅助靶标循环信号放大技术和G-四链体/氯化血红素DNA酶，构建了一种简单、灵敏、低成本的免标记化学发光适体传感器。利用适体特异性结合目标AFB1，核酸外切酶I (Exo I)特异性地剪切单链DNA的特性[23]，所构建的酶辅助靶标循环信号放大策略实现了目标AFB1的循环再利用，极大地提高了适体传感器的检测灵敏度。同时，G-四链体/氯化血红素DNA酶被巧妙地编码到发夹探针中用作化学发光的信号分子，避免了发夹探针的荧光标记和化学修饰。该适体传感器制备成本低，操作简单，对AFB1的检测灵敏度高、线性范围宽，并成功地应用于中药材样品中AFB1的测定，显示了良好的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SpectraMax M5e多功能酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司)；PHSJ-3F型精密酸度计(上海雷磁仪器有限公司)；Eppendorf 5417R小型台式冷冻型离心机(艾本德中国有限公司)；HS3120D超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)。

黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)购自中国广州分析测试中心科力技术开发公司；DEPC处理水和核酸外切酶I(Exo I)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；10×NEBuffer 3.1购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；三(羟甲基-1)氨基甲烷(Tris)、2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙磺酸(HEPES)、3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)、氯化血红素和H2O2购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；当归、党参和黄芪购自无锡市中医院。本文所用寡核苷酸由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其序列(见图1A)的颜色与图1B中的颜色相同。

1.2 发夹探针H1、H2和适体探针H1-S1的制备

发夹探针H1和H2：将寡核苷酸H1和H2的粉末以12 000 r/min离心5 min，分别加入20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(200 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.4)配成10 μmol/L标准储备液。将H1和H2的储备液分别加热至95 ℃，保持10 min后，缓慢冷却至室温以形成发夹结构，4 ℃保存备用。

适体探针H1-S1：将寡核苷酸S1的粉末以12 000 r/min离心5 min，加入20 mmol/L Tris-HCl缓冲液配成10 μmol/L标准储备液。将50 μL 10 μmol/L H1和50 μL 10 μmol/L S1混合，37 ℃孵育30 min，待H1和S1充分杂交后得到适体探针H1-S1的标准储备液，浓度为5 μmol/L，4 ℃保存备用。

1.3 核酸外切酶I辅助的靶标循环

将8 μL 1 μmol/L适体探针H1-S1、1 μL一定浓度的AFB1和1 μL 10 U/μL核酸外切酶I依次加入40 μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，100 μg/mL BSA，pH 7.9)中，37 ℃孵育60 min。然后，将反应液加热至80 ℃，保持15 min使核酸外切酶I失活，自然冷却至室温。再加入10 μL 1 μmol/L发夹探针H2和40 μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液，37 ℃孵育30 min，自然冷却后得到酶辅助靶标循环的反应产物。

1.4 G-四链体/氯化血红素DNA酶的制备及化学发光检测

将10 μL 2 μmol/L氯化血红素和40 μL 25 mmol/L HEPES缓冲液(200 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，1%二甲基亚砜，pH 7.4) 加入上述反应产物中，室温孵育60 min以形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。然后加入25 μL 1 mmol/L鲁米诺和25 μL 1 mmol/L H2O2，最终体积为200 μL。使用SpectraMax M5e多功能酶标仪记录各样品溶液的化学发光信号强度，检测步长设为2 nm，收集380 ～510 nm范围内的化学发光光谱，最大发射波长为418 nm。

2 结果与讨论

2.1 传感器的检测原理

图1B为基于酶辅助靶标循环的适体传感器检测AFB1的原理图。如图所示，该适体传感器主要由适体探针H1-S1、发夹探针H2、核酸外切酶I、氯化血红素、鲁米诺和H2O2组成。适体探针H1-S1和发夹探针H2均含有一段G-四链体序列(共18个碱基)，一部分位于发夹的环状区(12个碱基)，另一部分位于发夹的茎秆区(6个碱基)。当适体探针和发夹探针未打开时，该段序列不能折叠成G-四链体结构，因而不能结合氯化血红素形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。

当体系中不存在目标AFB1时，适体探针H1-S1和核酸外切酶I两者稳定共存，彼此不发生相互作用。这是因为适体探针H1-S1的末端是完全匹配的双链结构，而核酸外切酶I是单链特异性外切酶，不分解双链DNA。将核酸外切酶I灭活后，加入发夹探针H2，适体探针H1-S1的末端因完全匹配的双链结构同样不会和H2发生作用，使得两个探针在体系中共存。由于适体探针和发夹探针未打开，加入氯化血红素不会形成G-四链体/氯化血红素DNA酶，整个体系的化学发光信号可忽略不计。当体系中存在目标AFB1时，由于适体和靶标间的高亲和性，适体序列S1从适体探针H1-S1上脱离并与AFB1结合形成复合物AFB1-S1，适体探针H1-S1变为发夹探针H1。核酸外切酶I具有从3′-5′方向降解单链DNA的外切酶活性，能识别复合物AFB1-S1并逐步催化降解适体序列S1，释放出目标AFB1[24]。释放的AFB1可以结合一个新的适体探针形成复合物，接着再次被核酸外切酶I剪切后释放，不断循环参与结合/剪切反应，构成酶辅助的靶标循环(Cycle)。在靶标不断循环的过程中，生成了大量的发夹探针H1。这些发夹探针具有单链的3′-末段支臂，同样被核酸外切酶I剪切，而单链的5′-末段支臂未被剪切得以保留。核酸外切酶I灭火处理后，加入发夹探针H2与带有5′-末段单链支臂的发夹探针H1结合，生成复合物H1-H2。两个探针的发夹结构被打开，暴露出完整的G-四链体序列。G-四链体序列进一步折叠成G-四链体结构，并结合氯化血红素形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。这些DNA酶可以催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系，产生化学发光信号，从而实现AFB1的放大检测。

图1 3种核苷酸的序列(A)以及基于酶辅助靶标循环的适体传感器检测AFB1的原理图(B)Fig.1 Sequences of three oligonucleotides(A) ,and schematic diagram of AFB1 detection by aptasensor based on enzyme-assisted target recycling(B)

2.2 传感器的信号放大效果

为了验证酶辅助靶标循环策略的信号放大效果，在适体传感器的设计上移除了核酸外切酶I，从而构建了无信号放大的适体传感器(图2)。如图2A所示，该适体传感器主要由适体探针H1-S1、发夹探针H2、氯化血红素、鲁米诺和H2O2组成。同样地，当不存在目标AFB1时，两个探针在体系中稳定共存，彼此不发生相互作用。

图2 无信号放大的适体传感器检测AFB1的原理图(A)，以及无信号放大的适体传感器和酶辅助 靶标循环的适体传感器对同一浓度AFB1的化学发光响应图(B)Fig.2 Schematic diagram of AFB1 detection by aptasensor without signal amplification (A),and chemiluminescence responses of the aptasensor without signal amplification and the aptasensor with enzyme-assisted target recycling to the same concentration of AFB1 (B)

当存在目标AFB1时，适体序列S1和目标AFB1结合形成复合物AFB1-S1并从适体探针H1-S1上脱离，适体探针H1-S1变为发夹探针H1，并进一步与发夹探针H2进行杂交形成复合物H1-H2，导致发夹结构被打开并暴露出完整的G-四链体序列。G-四链体序列进一步折叠成G-四链体结构，并结合氯化血红素生成G-四链体/氯化血红素DNA酶。这些DNA酶催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系，产生化学发光信号。图2B是无信号放大的适体传感器和酶辅助靶标循环的适体传感器对同一浓度AFB1(100 ng/mL)的化学发光响应图。在无目标AFB1的情况下，两种传感器均显示出较低的化学发光响应(曲线a和b)。这说明适体探针H1-S1在溶液中既不会被核酸外切酶I剪切，也不会和发夹探针H2杂交。加入目标AFB1后，无信号放大的传感器可检测到1个明显的化学发光信号(曲线c)。据文献报道，在生物传感器构建过程中引入信号放大策略可显著提高检测灵敏度[25]。正如预期，采用酶辅助靶标循环信号放大策略构建的适体传感器的化学发光信号(曲线d)明显强于无信号放大的适体传感器，信号增强了74.43%，表明所构建的适体传感器具有良好的信号放大效果。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 适体探针H1-S1浓度的优化考察了不同浓度(20、30、40、50、60 nmol/L)适体探针H1-S1对AFB1检测的影响。结果显示，在适体探针浓度为40 nmol/L时，体系的化学发光强度比值I/I0最大，其中I和I0分别表示存在和不存在AFB1时的化学发光强度(λem=418 nm)。因此选择适体探针H1-S1的最佳浓度为40 nmol/L。

2.3.2 核酸外切酶I用量的优化考察了不同核酸外切酶I用量(6、8、10、12、14 U)对AFB1检测的影响。结果显示，随着核酸外切酶I用量的增加，体系的化学发光强度逐渐增加，但变化不大。考虑到核酸外切酶I的性价比，选择核酸外切酶I的最佳用量为10 U。

2.3.3 靶标循环反应时间的优化考察了不同靶标循环反应时间(40、50、60、70、80 min)对AFB1检测的影响。结果显示，随着反应时间的增加，体系的化学发光强度迅速增加然后趋于平缓，60 min后进入平台期。因此选择靶标循环反应时间为60 min。

2.3.4 适体探针H2浓度的优化考察了不同浓度(30、40、50、60、70 nmol/L)发夹探针H2对AFB1检测的影响。结果显示，加入50 nmol/L发夹探针H2时，体系的化学发光强度比值最大。因此选择发夹探针H2的最佳浓度为50 nmol/L。

2.4 黄曲霉毒素B1的检测

为了考察所构建适体传感器的检测性能，在最佳实验条件下，测试了该适体传感器对不同质量浓度(0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 ng/mL) AFB1的化学发光响应。如图3A所示，随着目标AFB1质量浓度在0～100 ng/mL范围内增加，其化学发光强度也相应增加。从图3B可以看出，化学发光强度与AFB1质量浓度呈指数对应的关系。此外，由插图可见，当AFB1质量浓度在0.001～100 ng/mL范围内时，化学发光强度(I)与AFB1质量浓度的对数(lgC)呈良好的线性关系，其线性方程为I=42 952+10 888lgC，相关系数(r2)为0.995 5。以3倍信噪比(S/N=3)计算得到AFB1的检出限为0.93 pg/mL。

2.5 特异性实验

特异性是衡量传感器性能的重要指标。选择黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)作为潜在的干扰物质(图4A为其化学结构式)，考察了适体传感器的特异性。由图4B可见，ZEN和OTA的化学发光信号和空白(Blank) 的化学发光信号无明显差异。AFB2、AFG1、AFM1与AFB1的分子结构相似，虽然同属于黄曲霉毒素家族，但其化学发光信号强度仅略高于ZEN和OTA，而目标AFB1的化学发光信号明显增强。结果表明所构建的适体传感器对AFB1具有良好的特异性。进一步使用无信号放大的适体传感器对同浓度的干扰物质进行特异性实验。通过对比实验发现，采用信号放大策略的适体传感器的IAFB1/IAFB2比值显著高于无信号放大的适体传感器的比值，表现出更为优良的特异性。这是因为在适体本身高特异性的基础上，信号放大策略可以进一步放大同家族成员间的差异，导致IAFB1/IAFB2比值升高。因此，该适体传感器的优良特异性可归因于适体和靶标分子间的高特异性与酶辅助靶标循环策略的高信号放大效率。

2.6 中药材样品中AFB1的检测

选取当归、党参和黄芪3种中药材作为实际样品，采用标准加入法进行回收率实验，以评估适体传感器对实际样品的检测能力。准确称取2 g中药材样品，加入5 mL甲醇-水(体积比6∶4)萃取液，浸泡60 min后超声处理45 min，然后将混合物以3 000 r/min离心5min。提取1 mL上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤后，用1×NEBuffer 3.1缓冲液定容至10 mL。将3种质量浓度水平(1、10、100 ng/mL)的AFB1加标至稀释的样品溶液中进行回收率实验，每个质量浓度平行测定3次。计算得AFB1的回收率为93.7%～107%，相对标准偏差(RSD)为3.7%～6.4%，表明所构建的适体传感器可用于中药材样品中AFB1的检测。

3 结 论

本文基于酶辅助靶标循环信号放大策略成功构建了一种用于AFB1高灵敏检测的适体传感器。所设计的适体探针和发夹探针，以G-四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子，无需任何化学修饰和荧光标记，制备成本低。整个反应在等温均一的溶液中进行，无需复杂的分离程序和耗时的热循环，操作简单。该适体传感器对AFB1的检测灵敏度高、线性范围宽、特异性好，并成功地应用于中药材样品中AFB1的测定。