抗阿尔兹海默症藏药三味豆蔻汤的化学成分分析研究

尕 曼，贺玖明，张瑞萍，李舒冉，刘庆山， 更 桑，多杰仁青，再帕尔·阿不力孜,*

(1.中国医学科学院 药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050；2.中央民族大学 药学院，民族医药教育部重点实验室，北京 100081；3.西藏藏医药大学 附属医院，西藏 拉萨 850000)

阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease，AD)是一种以进行性认知功能减退为特征的神经退行性疾病[1]，我国AD患者已达600万，是全球AD患者数量最多的国家[2]，因此加快发现及研发缓解或治疗AD的药物具有重要的现实意义。由于AD复杂的发病机制，多个单一特异靶点候选药物的临床研究遭遇失败；但发现多靶点的天然产物6-姜烯酚[3]、石衫碱甲等[4]在治疗AD的临床研究中显示出显著疗效，因此研发治疗AD的多靶点天然药物或中药(含民族医药)复方越来越备受关注。

藏药学是在广泛吸收、融合了中医药学及印度医药学等理论的基础上，通过藏族人民在长期生产生活中实践所形成的独特医药体系。三味豆蔻汤是藏药学中的经典方剂，最早来源于著作《四部医典》，由豆蔻、香旱芹、荜茇等药材组成，并经牦牛奶煎汤内服[5]。经长期实践，三味豆蔻汤在治疗失眠[6]、心绞痛[7]等方面具有较多的临床应用。蒙医学对该复方也有所研究，并将其称之为苏格木勒-3汤[7]。近年来，有研究指出三味豆蔻汤及其中单味药材的成分具有改善认知、保护神经细胞的功能，能够对AD起到一定治疗作用[8-14]。然而，对该方剂中的化学成分及其作用机制的研究较少，还缺乏相应的质量标准。因此，开展对三味豆蔻汤化学成分的系统分析，有助于了解该方剂的物质基础，为药效或毒理及其后续药理作用机制的研究提供科学依据。

因三味豆蔻汤由多味药材熬煮而成，其化学组成复杂，所含成分的理化性质差异大。据文献报道，豆蔻、香旱芹两种药材中含有大量的挥发油类成分[15-19]；荜茇中含有较高含量的生物碱类物质(如胡椒碱、荜茇明宁碱等[20-21])；而牦牛奶中含有大量氨基酸、脂肪酸等功效成分[22-23]。因此，针对三味豆蔻汤进行化学成分分析，采用单一分析技术的检测能力有限。气相色谱-质谱(GC-MS)作为效率高、重现性好的分析检测技术之一，适用于挥发性、低极性及相对分子质量较小成分分析(如挥发油、短链烷烃等[13])。而对于极性较大、热不稳定的非挥发性成分，液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术是理想的分析手段，其中超高效液相色谱-高分辨串联质谱(UPLC-HRMS/MS)技术结合了UPLC的高分离能力与质谱技术的高灵敏度、高选择性的结构鉴定能力，适用于含量少、不易分离获得或在分离过程中容易丢失的极性成分分析。若将GC-MS与UPLC-HRMS/MS技术联合使用，可大大提高对检测物的覆盖范围，获得更多的成分信息[24-26]。因此，本研究采用GC-MS与UPLC-HRMS/MS技术，深入开展了三味豆蔻汤的化学成分分析。

1 实验部分

1.1 药材来源及制备

三味豆蔻汤制备所用药材为印度豆蔻、香旱芹、荜茇。其中，印度豆蔻为生姜科植物小豆蔻(ElettariacardamomumMaton)的成熟果实；香旱芹为伞形科植物孜然芹(CuminumcyminumL.)的干燥成熟果实；荜茇为胡椒科胡椒属植物荜茇(PiperlongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗；均由西藏藏医药大学附属医院提供，并经中央民族大学生命与环境科学学院植物学教授龙春林鉴定确认。

本研究根据藏药三味豆蔻汤的制备方法：取适量印度豆蔻、香旱芹、荜茇，粉碎后将其混合物置于4 ℃牦牛奶(购自青海金祁连乳液有限责任公司，生产许可证号：SC10563222201028)中浸泡过夜，然后煎煮至原体积的2/3，经冷却、过滤制得三味豆蔻汤储备液，于-20 ℃冷藏，备用。

1.2 试剂与仪器

乙腈、甲醇(色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司)；甲酸、正己烷(色谱纯，美国Merck公司)；甲基叔丁基醚、氯仿(分析纯，北京化工厂)；实验用水为纯净水(杭州娃哈哈集团)。

单通道微量移液器(德国Eppendorf公司)；Adventurer AR1140分析天平(美国OHAUS公司)；MS3涡旋混合器(德国IKA公司)；Sigma 3-30K高速台式冷冻离心机(德国SIGMA公司)；A502220多孔氮吹仪(月旭科技股份有限公司)；ACQUITY UPLC I-Class液相色谱仪、UPLC HSS T3 色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm，美国Waters公司)；HP-5弹性石英毛细管柱、Q-orbitrap质谱仪(QExactive，配Xcalibur.Ink数据处理软件)(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Captiva 96孔板过滤装置、7890A/MSD5975C 气相色谱-质谱联用仪(配NIST05 MS Research质谱检索数据库)(美国Agilent Technologies公司)。

1.3 GC-MS法

1.3.1 样品前处理精密量取三味豆蔻汤10 mL，加入正己烷低温萃取10 h后，振荡240 s，离心取上清液，加入硫酸镁除水干燥，经氮气吹干，再加入200 μL正己烷复溶、振荡、离心、过滤，待GC-MS分析。

1.3.2 分析条件色谱条件：采用HP-5弹性石英毛细管柱进行气相色谱分离，进样口温度为250 ℃。程序升温：起始温度60 ℃，保持5 min；以3 ℃/min升至90 ℃，保持5 min；再以2 ℃/min升至200 ℃；最后以4 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，总运行时间为100 min[13]。载气为氦气，恒流模式，流速为0.8 mL/min，分流比为5∶1，进样量：1 μL。质谱条件：电离源：电子轰击源(EI)，离子源温度：250 ℃，轰击能量：70 eV。全扫描分析，质荷比范围：m/z50～550 Da。

1.4 UPLC-HRMS/MS法

1.4.1 样品前处理样品采用 “两相提取法”处理，分别得到弱极性和强极性组分：精密吸取三味豆蔻汤100 μL至10 mL玻璃管中，加3 mL甲醇-甲基叔丁基醚(MeOH-MTBE，体积比1∶1)，于2 500 r/min涡旋5 min，再以4 200 r/min(4 ℃)离心10 min，吸取上清液至干净的玻璃管中。向上清液中加入3 mL MTBE和1.2 mL H2O，2 500 r/min涡旋15 min，4 200 r/min(4 ℃)离心10 min，样品分层为上层有机相和下层水相。将上层有机相转入新的玻璃管中，得到弱极性组分萃取液；下层水相转入2 mL EP管，得到强极性组分萃取液。将两管样品用氮气吹干，在下层强极性提取物中加入100 μL 乙腈-水(ACN-H2O，体积比2∶98)复溶；上层弱极性提取物中加入400 μL 甲醇-三氯甲烷(MeOH-CHCl3，体积比1∶1)复溶。复溶样品在2 500 r/min涡旋5 min，在4 ℃条件下，分别将强极性提取物和弱极性提取物经12 500 r/min和4 500 r/min下离心5 min，分取上清液，经96孔板过滤，待UPLC-HRMS/MS分析。

1.4.2 分析条件样品使用ACQUITY UPLC I-Class液相色谱仪和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)分离，采用四极杆-静电场轨道阱(Q-Orbitrap)高分辨率串联质谱仪检测。①强极性提取物色谱条件：柱温：35 ℃，流速：250 μL/min，进样体积：5 μL。流动相：A为水(含0.1%甲酸)，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～8 min，2% B；8～17 min，2%～60% B；17～26 min，60% B；26～28 min，60%～100% B；28～38 min，100% B。②弱极性提取物色谱条件：柱温：45 ℃，流速：350 μL/min，进样体积：5 μL。流动相：A为水(含0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸铵)；B为乙腈-异丙醇(体积比1∶1,含0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸铵)；梯度洗脱程序：0～8 min，35% B；8～9 min，35%～50% B；9～12 min，50%～70% B；12～19 min，70%～90% B；19～24 min，90%～100% B；24～38 min，100% B。

质谱条件：采用全扫描(Full scan)与动态二级质谱扫描(Data dependent MS/MS,ddMS2)结合的方式，使用Xcalibur.Ink软件进行数据分析，获取检测物的质谱信息。具体参数为：离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描模式：正/负离子模式；毛细管电压：3 kV(+)/2.5 kV(-)；自动增益控制目标离子数(AGC Target)：3×106；最大离子注入时间：200 ms；离子传输管温度：350 ℃；质荷比范围：m/z100～1 500 Da；全扫描分辨率：70 000；二级质谱扫描分辨率：17 500；碰撞能量(NCE)：20 V/30 V/40 V；扫描时间：30 min。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS 前处理条件的优化

为尽可能多地检出低含量的挥发油类成分，考察了氮气吹干浓缩对GC-MS分析中检出峰个数以及信号强度的影响。结果显示：富集前(图1A)样品的总离子流图中检出59个峰，色谱峰丰度最高为2.8×105；富集后(图1B)检出87个峰且主要集中在70～90 min内(此时间段检出成分主要为分子量和极性相对较大的成分)，丰度最高为1.8×106，且在70～90 min内峰面积增大最为显著；表明通过富集可整体提高化合物检出个数及灵敏度。同时考察了不同时间段化合物的质谱信号响应与变化，发现10～40 min(多数为挥发性、小极性分子)化合物的相对强度在富集前后无明显升高或降低(如图1C、D)，可能在氮气吹干过程中有部分损失。而保留时间为70～90 min的检出物富集后的信号强度明显提高(如图1E、F)。由此可见，氮吹富集操作更有利于极性及分子量相对较大成分的富集。

2.2 GC-MS分析结果

经GC-MS分析并结合NIST05 MS数据库检索和谱图比对，选出匹配度最佳的化合物，以保证分析结果的准确性，并通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)以及相关文献[15,19-20,22-23]推断化合物可能来源。图2为部分化合物的质谱图，分别为1,3-二叔丁基苯(图2A)、乙酸松油酯(图2B)、棕榈酸(图2C)、胡椒碱(图2D)，这些化合物与NIST数据库中标准谱图的匹配程度均在90%以上。通过GC-MS分析和数据库比对，检出41个化合物(表1)，主要包括来源于豆蔻和香旱芹的含氧单萜及单萜烯类的桉油精、β-蒎烯、α-松油醇、α-蒎烯;来源于荜茇的长链烷烃(如十二烷、琼蜡烷)、长链烯酸(如月桂酸、棕榈酸)以及生物碱类物质(如胡椒碱)等。其中含氧单萜及单萜烯类化合物不仅质谱响应较低，其对应峰面积也普遍低于其他种类化合物，除氮气吹干的富集操作影响外，长时间熬煮也是影响其挥发油含量的因素之一。

表1 GC-MS分析结果Table 1 Analysis results of GC-MS

2.3 UPLC-HRMS/MS分析结果

针对该方剂的非挥发性成分，在前处理过程中分别获得强极性提取物和弱极性提取物，经UPLC-HRMS/MS方法获取其高分辨质谱和二级质谱信息，并通过中药综合数据库(Traditional Chinese Medicine Integrated Database,TCMID)、人类代谢数据库(Human Metabolome Database,HMDB)等检索和比对分析。结果显示，强极性组分中检出19个化合物的可能结构，主要包括氨基酸类(如苯丙氨酸)、肉碱类(如乙酰肉碱、异丁酰肉碱)、季铵盐类(如胆碱、醋甲胆碱)、黄酮苷类(如木犀草素-3-葡萄糖-7-鼠李糖苷)、香豆素类(如羟基香豆素)等。表2列出质谱响应较高且初步鉴定的9种特异性化合物，其他化合物结构尚需进一步鉴定与确认。由表中数据可见，大部分化合物是在中药材中比较少见的肉碱、胆碱、亚油酸、马尿酸等成分，分析认为可能主要来源于牦牛奶。

GC-MS检测范围为m/z50～550 Da，未覆盖弱极性但分子量在550 Da以上的化学成分，因此采用UPLC-HRMS/MS技术对弱极性提取物进行检测(扫描范围m/z100～1 500)。结果显示：经UPLC-HRMS/MS检测并初步鉴定出42个化合物(图3A)，以脂质为主，分析认为其主要来源于牦牛奶。在脂质亚型方面，检出9个三酰甘油类成分(Triacylglycerol,TG)，4个乳糖神经酰胺类成分(Lactosylceramide,LacCer)，6个磷脂酰乙醇胺类成分(Phosphatidyl ethanolamine,PE)，4个磷脂酰丝氨酸类成分(Phosphatidylserine,PS)和3个磷脂酰胆碱类成分(Phosphatidylcholine,PC)。图3B列出了质谱响应较高的前10个脂质类成分，主要为TG和PE类成分。除此之外，在正离子模式下还检出胡椒碱。在UPLC-MS/MS的强极性和弱极性组分中，均能检出蔗糖与乳糖。

表2 经UPLC-MS/MS检出的9种强极性组代表性物质鉴定结果Table 2 Identification results of 9 representative compounds in the polar group via UPLC-MS/MS

图3 分析获得的主要脂质亚型分类及个数(A)与质谱响应最高的前10种脂质(B)
Fig.3 Subtypes and numbers of major detected lipids(A) and top 10 detected lipids which have the highest intensity(B) TG:triacylglycerol(三酰甘油类);LacCer:lactosylceramide(乳糖神经酰胺类);PE:phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺类); PS:phosphatidylserine(磷脂酰丝氨酸类);PC:phosphatidylcholine(磷脂酰胆碱类)

综上，通过UPLC-HRMS/MS检出的大部分成分，包括肉碱及脂质类成分可能主要来源于牦牛奶。此外，还检测到主要来源于香旱芹的黄酮苷、香豆素类活性物质，弥补了GC-MS分析的不足。

3 结 论

本研究通过GC-MS技术共检出41种化合物，通过UPLC-HRMS/MS方法分别在强极性、弱极性提取物中检出19、42种成分，其中蔗糖与乳糖在强极性和弱极性组分中均被检出，胡椒碱在GC-MS和UPLC-HRMS/MS方法中均被检出，因而从三味豆蔻汤中共发现及初步鉴定出99个化学成分。通过本分析方法初步掌握了该方剂的物质基础，并结合分析结果、TCMSP、TCMID、HMDB数据库以及相关文献分析等，推断出三味豆蔻汤的代表性化合物及其来源分别为：来源于豆蔻和香旱芹的含氧单萜和单萜烯类成分(如桉油精、β-蒎烯、α-蒎烯)，来源于香旱芹的黄酮及黄酮苷类成分(如木犀草素-3-葡萄糖-7-鼠李糖苷)，来源于荜茇的长链烯酸类成分(如棕榈酸)和生物碱类成分(如胡椒碱)，以及来源于牦牛奶的甘油酯及磷脂类成分(如甘油三酯、磷脂酰乙醇胺、中性鞘糖脂)等。

本方法检出的部分成分治疗AD的药效作用在相关文献中已有报道或证实。如Gomaa等[8]提出挥发油中的含氧单萜和单萜烯类成分能够降低乙酰胆碱酯酶的活性和谷氨酸受体的表达，可应用于对AD的治疗。Paul等[11]研究表明从豆蔻中获得的含有桉油精的提取物与合成的桉油精相比，能够在体外更好地抑制自由基的产生，可防止β42-淀粉样蛋白(Amyloid beta-42,Aβ42)的积聚。此外，也有文献提出香旱芹中的枯茗醛可抑制突触蛋白纤维化过程[12,27]；木犀草素可能通过影响烟碱受体活性来减轻东莨菪碱或Aβ导致的记忆缺失等症状[28-29]；胡椒碱能够通过降低脂质过氧化程度和乙酰胆碱酯酶的活性起到改善认知的作用等[30]。因此，本研究结果可为三味豆蔻汤的配伍合理性提供了一定依据，为进一步开展药效、药物作用机制研究以及药物质量控制提供参考信息。