LncRNA MEG3表达量与脂多糖诱导支气管上皮细胞增殖及凋亡和炎症因子分泌的关系*

何秀 张碧清 刘春花

(1.郴州市第一人民医院儿科，湖南 郴州 423000;2.郴州市第一人民医院儿童医院儿童呼吸科，湖南 郴州 423000)

支气管哮喘属于慢性气道炎症类疾病之一，支气管上皮细胞损伤在支气管哮喘发生过程中发挥重要作用[1-2]。既往研究显示支气管上皮细胞释放出炎性因子可引发机体炎症反应从而造成损伤[3]。目前支气管哮喘发病机制尚未阐明，因而从支气管上皮细胞角度出发探究支气管哮喘发病机制具有重要意义。长链非编码RNA母系表达基因3(Long non-coding RNA MEG3，LncRNA MEG3)表达水平降低可增强脂多糖(lipopolysacharide，LPS)诱导的肺细胞损伤[4]。但MEG3在支气管哮喘发生过程中的调控机制尚未阐明。研究表明LPS作为一种促炎因子可用于炎症性疾病的体外研究[5-7]。本研究分析LPS对支气管上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子分泌的影响，探讨干扰MEG3表达或MEG3过表达对LPS诱导的支气管上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子分泌的影响，为支气管哮喘发病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人支气管上皮细胞16HBE购自美国ATCC细胞库；杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清均购自美国HyClone公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)与白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；脂多糖(LPS)与甲基噻唑基四唑(MTT)购自美国Sigma公司；Lipofectamine2000、Triol试剂盒、反转录试剂盒与实时荧光定量检测试剂盒均购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒购自湖南艾佳生物科技股份有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液购自福因德科技(武汉)有限公司；MEG3小干扰RNA(si-MEG3)、乱序无意义阴性序列(si-con)购自广州锐博生物科技有限公司；pcDNA3.1购自上海柯雷生物科技有限公司；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved caspase-9)、细胞周期蛋白1(CyclinD1)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS处理与实验分组 预先配置含有10%胎牛血清与100 U/mL青霉素与100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，将支气管上皮细胞16HBE置于培养基中进行培养，培养条件：37 ℃、体积分数5%CO2培养箱，待单层细胞覆盖率达到90%时进行传代培养。取对数生长期支气管上皮细胞，用50 μg/mL的LPS处理细胞24 h[8]作为LPS组，正常培养的细胞作为NC组。分别将si-MEG3、si-con、pcDNA-MEG3、pcDNA转染至支气管上皮细胞48 h，随后使用50 μg/mL的LPS处理细胞24 h，分别命名为LPS+si-MEG3组、LPS+si-con组、LPS+pcDNA-MEG3组、LPS+pcDNA组，转染过程参照Lipofectamine2000试剂说明书进行操作，收集细胞进行后续研究。

1.2.2 ELISA检测IL-8、IL-1β浓度 收集各组细胞培养上清液，依据ELISA检测试剂盒检测IL-8、IL-1β水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 MTT检测细胞增殖率 取NC组、LPS组、LPS+si-con组、LPS+si-MEG3组、LPS+pcDNA组、LPS+pcDNA-MEG3组支气管上皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度至3×104个/mL，取100 μL细胞悬液接种于96孔板，各组设置3个复孔，培养48 h后每孔加入20 μL质量浓度为5 mg/mL的MTT溶液，室温孵育4 h，12000 r/min转速离心5 min，弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，放入振荡仪匀速振荡10 min，应用酶标仪检测波长为490 nm处各孔吸光度值(OD)，计算各组细胞增殖率[(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%]，实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集NC组、LPS组、LPS+si-con组、LPS+si-MEG3组、LPS+pcDNA组、LPS+pcDNA-MEG3组支气管上皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min转速离心6 min，弃上清，PBS清洗，加入500 μL结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中MEG3的表达水平 收集各组支气管上皮细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计测定RNA浓度，根据反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA。MEG3正向引物5′-GGGCTTCTGGAATGAGCA TG-3′，反向引物：5′-TCTATGCCAGATCCTGCCT G3′；β-actin正向引物5′-TGCTGTCCCTGTATGCC TCT-3′，反向引物：5′-TGATGTCACGCACGATT T-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。qRT-PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：95℃ 2 min(循环1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循环40次)，MEG3以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算MEG3的相对表达量。

1.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot)检测Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CyclinD1蛋白表达 收集各组支气管上皮细胞，加入RIPA裂解液，冰浴30 min，离心(4 ℃，1000 r/min，10 min)，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白上样量加入SDS上样缓冲液，沸水中煮10 min。取蛋白样品进行SDS-PAGE反应，将电泳产物转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃条件下孵育一抗稀释液(24 h)，TBST洗涤，孵育二抗稀释液，室温孵育1 h，TBST洗涤，曝光，显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 LPS诱导支气管上皮细胞炎症反应和抑制增殖的作用 与NC组相比，LPS组支气管上皮细胞中炎症因子IL-8、IL-1β水平均明显升高(P<0.05)，细胞增殖率显著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，见图1、表1。

图1 Western blot检测支气管上皮细胞CyclinD1蛋白表达Figure 1 Western blot detection of CyclinD1 protein expression in bronchial epithelial cells

表1 LPS诱导支气管上皮细胞炎症因子IL-8和IL-1β分泌及抑制增殖的作用Table 1 Effects of LPS on the secretion of inflammatory factors IL-8 and IL-1β in bronchial epithelial cells and inhibition of proliferation

2.2 LPS诱导支气管上皮细胞凋亡 相较于NC组，LPS组支气管上皮细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，见图2、表2。

图2 Western blot检测支气管上皮细胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达及流式细胞术检测细胞凋亡率Figure 2 Western blot detection of Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 protein expression in bronchial epithelial cells and flow cytometry to detect the apoptosis rate

表2 LPS诱导支气管上皮细胞凋亡及上调Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白Table 2 LPS-induced bronchial epithelial cell apoptosis and up-regulated Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 proteins

2.3 LPS抑制支气管上皮细胞MEG3表达 LPS组MEG3的表达水平(0.42±0.06)较NC组(0.97±0.05)显著降低(P<0.05)。

2.4 干扰MEG3加重LPS诱导支气管上皮细胞凋亡和抑制增殖的作用 与LPS+si-con组相比，LPS+si-MEG3组支气管上皮细胞中MEG3的表达水平显著降低(P<0.05)，提示成功降低支气管上皮细胞中MEG3的表达；相比于LPS+si-con组，LPS+si-MEG3组支气管上皮细胞中IL-8、IL-1β水平、细胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)，细胞增殖率、CyclinD1蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)，见图3、表3。

图3 Western blot检测支气管上皮细胞CyclinD1、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达及流式细胞术检测细胞凋亡率Figure 3 Western blot detection of cyclinD1,cleaved caspase-3,and cleaved caspase-9 protein expression in bronchial epithelial cells and detection of apoptosis rate by flow cytometry

表3 沉默MEG3和LPS诱导对支气管上皮细胞炎症因子IL-8和IL-1β分泌、细胞增殖及细胞凋亡的作用Table 3 Effects of silent MEG3 and LPS induction on the secretion of inflammatory factors IL-8 and IL-1β,cell proliferation and apoptosis in bronchial epithelial cells

2.5 过表达MEG3部分逆转LPS诱导支气管上皮细胞凋亡和抑制增殖的作用 与LPS+pcDNA组相比，LPS+pcDNA-MEG3组支气管上皮细胞中MEG3的表达水平、细胞增殖率、CyclinD1蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)，IL-8、IL-1β水平、细胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)，见图4、表4。

表4 过表达MEG3和LPS诱导对支气管上皮细胞炎症因子IL-8和IL-1β分泌、细胞增殖及细胞凋亡的作用Table 4 Effects of overexpression of MEG3 and LPS on the secretion of inflammatory factors IL-8 and IL-1β,cell proliferation and apoptosis in bronchial epithelial cells

图4 Western blot检测支气管上皮细胞CyclinD1、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达及流式细胞术检测细胞凋亡率Figure 4 Western blot detection of cyclinD1,cleaved caspase-3,and cleaved caspase-9 protein expression in bronchial epithelial cells and flow cytometry to detect the apoptosis rate

3 讨论

LncRNA在支气管上皮细胞恶性转化过程中发挥重要作用，但关于其具体作用机制尚未完全阐明[9-11]。研究表明LPS可诱导支气管上皮细胞构建炎症模型[12-13]。因而本研究主要探寻新型LncRNA并分析其对LPS诱导的支气管上皮细胞炎症损伤的影响。

本研究结果显示LPS处理后支气管上皮细胞炎症因子 IL-8、IL-1β生成量均显著升高，与郑辉等[14]报道相似，提示LPS诱导的支气管上皮细胞炎症损伤模型构建成功，LPS诱导后支气管上皮细胞增殖率显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示LPS可通过抑制支气管上皮细胞增殖及促进细胞凋亡从而造成细胞损伤。研究表明CyclinD1表达量升高可促进细胞周期由G1期进入S期，促进细胞增殖[15]。Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表达量升高可诱导细胞凋亡[16]。本研究结果显示LPS诱导的支气管上皮细胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达水平显著升高，CyclinD1蛋白表达水平显著降低，提示LPS对支气管上皮细胞增殖及凋亡的作用机制可能与上调Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表达及下调CyclinD1表达有关。

MEG3在骨性关节炎患者软骨组织中呈低表达并可能通过调控血管生成从而参与骨性关节炎发生及发展过程[17]。研究表明MEG3在冠状动脉粥样硬化中呈低表达并可能参与心血管疾病发生及发展过程[18]。相关报道指出MEG3在急性髓系白血病骨髓中表达下调并可能作为急性髓系白血病患者预后不良的重要标志物[19]。但MEG3对LPS诱导的支气管上皮细胞炎症损伤的影响尚未可知。本研究结果显示LPS诱导的支气管上皮细胞中MEG3表达下调，干扰MEG3表达后可明显促进LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡，抑制细胞增殖，增加IL-8、IL-1β生成量，促进Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达，抑制CyclinD1蛋白表达，提示干扰MEG3表达可加重LPS诱导的支气管上皮细胞损伤；MEG3过表达后可抑制LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡，促进细胞增殖，降低IL-8、IL-1β生成量，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达下调，CyclinD1蛋白表达上调，说明MEG3过表达可逆转LPS诱导支气管上皮细胞凋亡及抑制增殖的作用。提示MEG3过表达可减轻LPS诱导的支气管上皮细胞损伤。

4 结论

MEG3过表达可促进LPS诱导支气管上皮细胞增殖，抑制细胞凋亡，减轻炎症反应。