响应面法优化糜子油提取率

金 灿，李克虎，Harold Corke，降彦苗✉

（1. 上海交通大学 农业与生物学院 食品科学与工程系，上海 200240；

2. 河北省农林科学院 谷子研究所，河北 石家庄 050035；3. 贵州大学 生命科学学院 生物技术系，贵州 贵阳 550025）

糜子（Panicum miliaceumL.）俗称大黄米，属于禾本科植物，被认为是人类历史上最早驯化的谷物之一[1]。其籽粒富含淀粉、蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质，多酚和纤维素也含量丰富[2-3]。有研究表明糜子油主要含亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸[4]，Shen等的研究也表明，糜子油脂肪酸组成主要以不饱和脂肪酸为主[5]。膳食中摄入不饱和脂肪酸可以有效降低患心血管疾病的风险[6]。随着国民生活水平的不断提高，人们越来越重视日常食用油的营养价值和质量安全，对食用油多样化的需求明显提高，市场上已经涌现出山茶油、红花籽油、核桃油等多种多样的食用油产品[7]。当前糜子产品结构单一，为了提升糜子的产品附加值，糜子油在食品及非食品工业中的应用值得探索。

目前，对糜子油的提取工艺研究不多。响应面法（Response Surface Methodology）是以数学科学为原理，利用统计方法，对所研究响应值进行优化，响应值的结果受多个变量影响。响应面法在许多研究领域都有非常广泛的应用，涵盖生物学、医学、生态学、食品学、工程学等多个领域[8]。响应面法在食品领域中的应用主要有两个方面：确定食品中各组分的相互作用已经确定各成分的比例、确定最优反应。本实验旨在采用响应面法，以糜子油提取率为指标，明确液料比、提取温度及提取时间对糜子油得率的影响，确定实验室索氏提取糜子油的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糜子：宁夏固原；石油醚（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；砻谷机（JLG-ⅡA）：中储粮成都储藏研究院有限公司；高速粉碎机（HC-700Y）：永康市天祺盛世工贸有限公司；脂肪测定仪（SZC-101）：上海纤检仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9030A）：上海精宏实验设备有限公司；电子天平（LE204E/02）：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糜子油提取方法

将糜子籽粒用砻谷机脱去外壳，烘干至恒重后，用高速粉碎机将糜子籽粒打成粉末状备用。用滤纸准确称取2 g（精确到0.001 g）糜子粉，包裹后放入滤纸筒。将样品放入脂肪测定仪并打开循环冷凝水，样品杯中加入一定比例的石油醚，在脂肪测定仪上经过浸泡 30 min、淋洗 30 min、回收15 min、蒸干10 min后取出浸提杯，于130 ℃下烘干40 min。然后，取出样品杯进行称重，计算糜子油的得率。重复三次实验，计算得率的平均值。

式中：M1为提取后样品杯与油的质量（g）；M0为提取前空的样品杯的质量（g）；M为样品糜子粉末的质量（g）。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 液料比对石油醚提取糜子油得率的影响设置提取温度75 ℃，提取时间20 min，研究液料比（V/M）分别为5、10、15、20、25、30 mL/g时，对糜子油得率的影响。

索氏提取法：用滤纸准确称取 2 g（精确到0.001 g）糜子粉，包裹后放入滤纸筒，放入脂肪测定仪并打开循环冷凝水，每个样品杯中加入一定比例的石油醚，打开脂肪提取仪进行四个阶段的温度和时间设置：（1）浸泡：55 ℃，30 min；（2）淋洗：75 ℃，20 min；（3）回收：95 ℃，15 min；（4）蒸干：110 ℃，10 min。在液料比（V/M）分别为5、10、15、20、25、30 mL/g的条件下进行6个不同提取条件的提取实验。然后，取出样品杯进行称重，计算糜子油的得率。每个提取条件下重复三次实验，记录得率的平均值。

1.2.2.2 提取时间对石油醚提取糜子油得率的影响 当提取温度为 80 ℃，液料比（V/M）为20 mL/g时，研究提取时间分别为 10、15、20、25、30、35、40 min时，糜子油得率的变化。

操作步骤和实验条件同 1.2.2.1，在第二步的提取（淋洗）时间分别为10、15、20、25、30、35、40 min的条件下进行7个不同提取条件的提取实验。每个提取条件下重复三次实验，计算得率的平均值。

1.2.2.3 提取温度对石油醚提取糜子油得率的影响 当提取时间为 30 min，液料比（V/M）为20 mL/g时，在提取温度分别为65、70、75、80、85、90 ℃时，研究其对糜子油得率的影响。

操作步骤和实验条件同 1.2.2.1，在第二步，将提取温度分别设置为 65、70、75、80、85、90 ℃，进行6个不同提取条件的实验。每个提取条件下重复三次实验，计算得率的平均值。

1.2.3 响应面实验设计

在对单因素实验的结果进行分析的基础上，运用Design Expert 10软件设计响应面，对液料比、提取时间、提取温度这 3个因素分别选定 3个水平，按中心组合设计寻找最佳提取工艺条件。液料比、提取时间、提取温度的主要水平编码表如表1和表2所示。

表1 单因素实验因素水平表Table 1 Factors and levels in one-factor experiments

表2 响应面实验因素水平表Table 2 Factors and levels in response surface test

1.3 数据处理

单因素实验结果用 Microsoft Office Excel 2016对其进行分析，利用Design Expert 10软件对工艺参数的组合进行优化，利用响应面分析法（RSM）得到回归模型和工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 提取液料比对糜子油得率的影响

以石油醚为提取溶剂，当提取温度为75 ℃，提取时间为20 min时，研究液料比（V/M）分别为5、10、15、20、25、30 mL/g时，对糜子油的得率的影响。结果如图1所示。

图1 液料比对糜子油的得率影响Fig.1 Effect of liquid material ratio on yield of proso millet oil

由图1可知，在液料比为5～20的范围内，糜子油的得率与液料比呈正相关性，糜子油得率随液料比的增大而增加。当液料比为20时，糜子油的得率达到最大值2.90%。当液料比大于20后，得率会随液料比的增加而逐渐减小至平缓。

原因可能是在一定液料比的范围内，溶剂量的增加提高了原料糜子粉与溶剂间的浓度差，促进了提取溶剂石油醚与原料糜子粉的接触，因此糜子油的得率有所提高，但此时再继续增加溶剂的用量，会导致溶剂挥发速度加快[9]，使糜子油的得率下降甚至趋于平缓，而且溶剂用量的加大还会增加物质成本。综合考虑，最适液料比（V/M）范围选取为 15、20、25 mL/g，进而继续对糜子油的得率进行响应面分析，以确定最佳的液料比。

2.1.2 提取时间对糜子油得率的影响

以石油醚为提取溶剂，当提取温度为80 ℃，液料比（V/M）为20 mL/g时，研究提取时间分别为10、15、20、25、30、35、40 min时，对糜子油得率的影响。结果如图2所示。

图2 提取时间对糜子油的得率影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of proso millet oil

结果表明，在10～30 min内，糜子油的得率与提取时间呈正相关，随着提取时间的延长，糜子油的得率不断增加。在30 min时，糜子油的得率为最大值2.91%。而当时间大于30 min之后，随着时间的增加，糜子油的得率开始减小。

这可能是因为在一定时间范围内，随时间的延长，油料分子与溶剂分子的接触会更加充分完全，有利于油脂的充分提取，因此得率随着时间的延长而增加。在一定时间之后接触达到平衡，此时再随着时间的延长，原料分解，导致杂质溶出，从而降低糜子油的得率，甚至还会增加时间成本[10]。综合考虑，提取温度选取25、30、35 min这三个水平，继续对糜子油的得率进行响应面分析，以确定最佳提取时间。

2.1.3 提取温度对糜子油得率的影响

以石油醚为提取溶剂，当提取时间为30 min，液料比（V/M）为20 mL/g时，研究提取温度分别为 65、70、75、80、85、90 ℃时，对糜子油得率的影响。结果如图3所示。

图3 提取温度对糜子油的得率影响Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of proso millet oil

由图3可知，在65～80 ℃范围内，糜子油的得率与提取温度呈正相关性，得率随提取温度升高而增加。当提取温度为 80 ℃时，糜子油的得率达到最大值3.01%。当提取温度大于80 ℃后，其得率随提取温度的升高而减小。

原因可能是在适当的温度条件下，分子热运动随温度增加而剧烈，促进物料与溶剂分子间的相对运动，从而有利于油脂的浸出扩散。但当温度过高接近溶剂沸点时，溶剂汽化量增加，挥发性物质增多，压力增加，从而阻碍了油脂浸出[11]。综合考虑，提取温度选取 75、80、85 ℃三个水平，继续对糜子油得率进行响应面分析，以确定最佳提取温度。

2.2 石油醚提取糜子油工艺优化响应面实验

2.2.1 响应面实验模型拟合

为了获得索氏提取法提取糜子油的最佳工艺条件，采用正交设计法，以得率为响应值，研究不同因素之间的综合效应，根据单因素实验结果，对液料比（mL/g）、提取时间（min）、提取温度（℃）进行3因素3水平实验设计。

以单因素实验结果为依据，以液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、三个因素为自变量，以糜子油得率（Y）为响应值，通过 Design-Expert 10软件对糜子油提取工艺的参数进行Box-Benhnken实验设计。实验因素和水平的设计如表3所示。

表3 响应面实验因素组合表Table 3 Combination of experimental factors in response surface test

2.2.2 响应面实验结果显著性分析

响应面分析方案及实验结果如表4所示；回归模型和方差分析结果如表5所示。

表4 响应面实验结果表Table 4 Results of response surface test

用Design-expert得到了二次多元回归拟合方程：Y=3.00+0.056A+0.050B+0.10C–0.12AB+0.030AC–0.023BC–0.41A2–0.35B2–0.31C2

对此模型方程进行方差分析，从表 5的方差分析结果中可以看出回归模型呈极显著（P<0.01），失拟项无显著性（P>0.05），回归方程的相关系数R2=0.991 3，校正后的相关系数。意味着方程中的自变量与因变量的线性关系显著，该方程可用于石油醚索氏提取糜子油的提取工艺优化。

表5 回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance in regression model

各实验因素对糜子油提取率的影响为：C>A>B，一次项中A的偏回归系数显著（P<0.05），说明液料比对糜子油的提取率有显著性影响，B的偏回归系数显著（P<0.05），说明提取时间对糜子油的提取率有显著影响，而C的偏回归系数极显著（P<0.01），说明提取温度对糜子油的提取率有极显著影响。交互项AB对提取率影响极显著（P<0.01），AC、BC对提取率的影响不显著（P>0.05）。二次项中的A2、B2和C2对提取率的影响均为极显著（P<0.01）。

2.3 响应面和等高线图分析

2.3.1 提取时间和液料比的交互作用

在提取温度为 80 ℃下，三维面较陡，等高线呈椭圆形。表明提取时间和液料比的交互作用显著，用石油醚提取糜子油的得率受到二者的共同影响。其中液料比坡度比提取时间的三维面稍微陡一些，说明液料比对糜子油的得率有显著性影响。当提取时间在27～31 min之间，液料比在19～23 mL/g之间时，糜子油的得率达到最大值，随着提取时间和液料比的变化，糜子油的得率会下降。

图4 因素A、因素B响应面分析图及等高线分布图Fig.4 F actor A, B response surface analysis map and contour map

2.3.2 提取温度和液料比的交互作用

在提取时间在30 min时，三维面较陡，说明糜子油的得率受到二者的共同影响。等高线呈圆形，说明提取温度和液料比的交互作用不明显。其中提取温度和液料比都对糜子油的得率有显著影响。当提取温度在79～83 ℃范围内，液料比在19～23 mL/g范围内，糜子油的得率达到最大值，随着提取温度和液料比的变化，糜子油得率会下降。

图5 因素A、因素C响应面分析图及等高线分布图Fig.5 F actor A, C response surface analysis map and contour map

2.3.3 提取温度和提取时间的交互作用

在提取的液料比为20 mL/g的条件下，三维面较陡，等高线呈圆形。表明提取温度和提取时间的交互作用不显著，但其中提取温度和提取时间都对糜子油的得率有显著影响。当提取时间在29～33 min之间，提取温度在79～83 ℃之间时，糜子油的得率达到最大值，随着提取温度和提取时间的变化，糜子油得率会下降。

图6 因素B、因素C响应面分析图及等高线分布图Fig.6 F actor B, C response surface analysis map and contour map

3 结论

用Design-Expert对数据进行预测以确定糜子油索氏提取工艺条件的最佳参数。结果表明：液料比为20.34 mL/g、提取时间为30.27 min、提取温度为 80.86 ℃时，在此提取条件下糜子油的预测最高得率为3.008%。为了实验的方便和可操作性，对此模型进行修正为：液料比为 20 mL/g、提取时间为30 min、提取温度为80 ℃。在修正后的提取条件下，糜子油的得率为 3.01%，与预测结果接近，证明该模型可以用于索氏提取法提取糜子油并验证其得率的相关实验。