外源SA、GSH对Cd胁迫下绵毛水苏生理和生长的影响

蔡仕珍 龙聪颖 邓辉茗 叶 充 李 璟

(1四川农业大学风景园林学院,四川 成都 611130;2宜宾职业技术学院,四川 宜宾 644003)

我国是重金属污染的重灾区,Cd污染点位超标率达7%[1]。Cd是毒性最强的无机污染物[2],易溶于水,易迁移富集到生物体,致使生物体畸变[3],已成为影响环境安全的重要因素。植物可以吸收土壤重金属[4],但植物吸收和耐受重金属的能力有限,高浓度的Cd会干扰植物的光合作用、呼吸作用以及营养元素的吸收和转运,引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)积累,使植物遭受氧化胁迫[5-6],抑制植物的生长,甚至造成植物死亡。研究发现,苦楝幼苗耐Cd胁迫的阈值约为120mg·kg-1(土壤Cd浓度)[7],Cd浓度大于40 mg·kg-1会抑制龙葵幼苗的生长[8],Cd浓度大于10 mg·kg-1对石竹毒害作用随浓度和时间的增加而增强[9]。提高植物对Cd的耐受力是完成Cd污染土壤植物修复的关键,而通过施用外源化学物质调控植物生理生化反应,可以缓解镉对植物的胁迫。水杨酸(salicylic acid,SA)是细胞内的信号传递分子,对植物的生长发育具有多种生理调节效应[10]。谷胱甘肽(glutathione,GSH)是植物体内重要的非酶抗氧化剂,能直接清除单线态氧以及H2O2等多种ROS自由基,也可以通过抗坏血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione,AsA-GSH)循环间接清除H2O2等[11-12]。添加外源物质SA能缓解重金属Cd对鸢尾[13]、黑麦草[6]的毒害作用,增强其抗重金属胁迫的能力[14];外源GSH对缓解Cd胁迫也具有一定的作用[15-16],但SA和GSH是否具有广泛的影响效果尚需进一步研究。

绵毛水苏(Stachyslanata)为唇形科水苏属多年生观赏草本植物,具有生长速度快,观赏期长,喜光、耐寒、耐旱,管理粗放等特点[17],广泛应用于花镜、岩石园中,市场前景较好。目前关于重金属胁迫下绵毛水苏的生长和生理响应的研究较少,而外源物质对绵毛水苏重金属胁迫的影响研究更是鲜见。因此,本研究采用土壤盆栽试验,通过外源喷施不同浓度的SA和GSH,研究其对Cd胁迫下绵毛水苏生长、生理的影响,以及对绵毛水苏吸收转运重金属Cd的影响,以期为开发利用绵毛水苏提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为绵毛水苏幼苗,种子购于美国泛美种子公司。

1.2 试验设计

1.2.1 处理土壤的准备 将土壤自然风干、捣碎、剔除杂物、研磨,过5 mm钢筛。然后按草炭土∶自然土∶珍珠岩(体积比)=1∶1∶1混合均匀,并用800倍多菌灵消毒。按每盆1.5 kg将基质装入带托盘的聚乙烯塑料花盆中,花盆口径25 cm,高20 cm,基质本底Cd含量0.12 mg·kg-1。分析纯CdCl2·2.5H2O固体溶解到离子水中配制300mg·kg-1Cd,每盆100mL溶液,分别加入处理土壤中,零添加Cd土壤加入等体积的去离子水,拌匀土壤,放置平衡半个月后用于试验。

1.2.2 材料培养及试验处理 供试绵毛水苏于2018年3月播种培育,待幼苗长至两片真叶时进行分苗。选取60株符合培养要求、生长旺盛、长势相近的幼苗分别移植于装有相应处理土壤的聚乙烯塑料花盆中,每盆1株,移栽后用去离子水浇透,放入温室内(透光率80%,温度25±3℃,相对湿度70%)培养,培养10 d,于植株长至3～5片叶时进行外源SA和GSH的处理。

试验共设10个处理,每处理6盆,每盆1株,共60株。其中包括仅300 mg·kg-1Cd处理1个,记作Cd300;300 mg·kg-1Cd处理后叶片喷施不同浓度SA处理4个(SA浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1),依次记作Cd300+SA0.5、Cd300+SA1.0、Cd300+SA1.5、Cd300+SA2.0;300 mg·kg-1Cd处理后叶片喷施不同浓度GSH处理4个(GSH浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4 mmol·L-1),依 次 记 作Cd300+GSH0.1、Cd300+GSH0.2、Cd300+GSH0.3、Cd300+GSH0.4;以零添加Cd和外源物质为对照,记作CK。每天早上8:00―10:00,对植株叶面喷施外源SA、GSH,CK和Cd300均浇灌相同体积的去离子水,每次均喷至叶片滴液为度,每处理喷50 m L。连续喷施7 d,于首次喷施后第1、第3和第7天取部分植株叶片测定各项生理指标,剩余植物继续培养至首次喷施后30 d收获全株。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 形态指标与干物质积累测定 于喷施后第7和第30天拍照记录植物的形态、叶色;首次喷施后第30天收获植株,自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3遍,滤纸擦干表面水分,每处理选择3株长势相近的植株,用游标卡尺测定植株根长(基部到植株最长根的距离);然后将植物地上部和地下部分开,于105℃杀青30min,80℃恒温烘干至恒重,称得地上部、地下部干重。

1.3.2 生理指标测定 随机选取植株从下至上第3对完全展开叶片测定植物的各项生理指标。游离脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮法[18],可溶性糖含量测定参照王学奎[18]的方法,可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[18];超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)活性测定采用氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium,NBT)法[19];过氧化氢酶(catalase,CAT)活性测定采用紫外吸收法[19];过氧化物酶(peroxidase,POD)活性测定采用愈创木酚法[19]。

1.3.3 Cd含量测定 首次喷施后第30天取样,将绵毛水苏地上部和地下部样品烘干、粉碎,称取0.5 g,放入聚四氟乙烯水热反应釜中,采用混合酸(高氯酸∶硝酸=1∶5,v∶v)氧化,再将聚四氟乙烯水热反应釜放入高压消煮罐中,用烘箱加热消解,待样品消解完全,冷却至室温后过滤,定容,并转移至50 mL白色塑料瓶内。采用AA320N型原子吸收分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)测定Cd含量。

1.4 数据处理

利用Excel 2007对试验所有原始数据进行初步计算,再用SPSS 19.0进行单因素方差分析和差异显著性检验(LSD法),并采用Excel 2007绘制相关图表。所有数据为平均值±标准差,显著性水平设定为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 外源SA和GSH对Cd胁迫下绵毛水苏生长指标的影响

2.1.1 外源SA和GSH对Cd胁迫下绵毛水苏形态的影响 由图1可知,外源喷施处理第7天,与CK相比,单一300 mg·kg-1Cd处理植株叶缘逐渐发黄卷曲,叶片肉质化程度加深,丝状绒毛密度增加,表现出较重的胁迫状态。随着外源SA浓度增加,绵毛水苏发黄叶片数量减少,卷曲度降低,萌蘖芽增多,但叶片肉质化程度降低,丝状绒毛减少;外源喷施GSH后,绵毛水苏叶片黄叶数随GSH浓度增加而减少,0.3和0.4 mmol·L-1GSH处理的叶色较深。

由图2可知,处理第30天,与CK相比,单一300 mg·kg-1Cd处理植株叶片更加卷曲,发黄坏死叶增多。外源喷施SA后,喷施浓度为0.5和1.0mmol·L-1处理的植株叶片发黄脱水死亡,而喷施浓度为1.5 mmol·L-1处理较CK黄叶数减少,叶片肉质化程度增加,丝状绒毛增多,喷施浓度为2.0 mmol·L-1处理黄叶较多,有新生叶片;而外源喷施GSH后,喷施浓度为0.1和0.2 mmol·L-1处理的老叶发黄脱落,喷施浓度为0.3 mmol·L-1处理的新生萌蘖芽较多。表明1.5 mmol·L-1SA和0.3 mmol·L-1GSH对Cd胁迫具有较佳的缓解作用。

2.1.2 外源SA和GSH对Cd胁迫下绵毛水苏株高、根长和干重的影响 如表1所示,与CK相比,单一300 mg·kg-1Cd处理显著抑制了绵毛水苏根的生长以及地上和地下部干物质的积累(P＜0.05)。外源喷施SA和GSH处理后,绵毛水苏根长、地上部干重和地下部干重均高于单一300 mg·kg-1Cd处理。其中,外源喷施SA处理后根长、地上部干重、地下部干重三个指标最大值分别出现在SA浓度为1.5、1.0和2.0 mmol·L-1,分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加61.16%、34.55%和57.14%;而外源喷施GSH处理后,随着GSH浓度增加,根长和地下部干重先升高后降低,最大值均出现在GSH浓度为0.2mmol·L-1,地上部干重则逐渐上升,根长、地下部干重、地上部干重最高分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加38.10%、100%、36.36%。表明SA和GSH对绵毛水苏Cd胁迫均有缓解作用,但不同浓度作用效果有所差异。

2.2 外源SA和GSH对Cd胁迫下绵毛水苏生理的影响

2.2.1 外源SA和GSH对Cd胁迫下绵毛水苏渗透调节物质的影响 如图3～4所示,与CK相比,单一300 mg·kg-1Cd处理下,绵毛水苏叶片可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和游离脯氨酸含量分别下降了26.15%、15.42%和32.17%。

表1 不同浓度的外源SA、GSH对Cd胁迫下绵毛水苏根长以及地上部、地下部干重的影响Table1 Effects of different concentrations of exogenous SA and GSH on root length and dry weight of above ground part and underground part of S.lanata under Cd stress

喷施外源SA处理第1天,随着SA浓度增加,绵毛水苏叶片可溶性糖含量上升,可溶性蛋白含量变化幅度较小,游离脯氨酸含量先急剧升高后缓慢下降,并在SA浓度为1.0 mmol·L-1时达到最大值;与单一300 mg·kg-1Cd处理相比,可溶性糖含量增幅达12.6%,游离脯氨酸达90%。处理第3和第7天,三个指标均随着SA浓度增加呈先升高后降低的趋势。其中,可溶性糖含量最大值分别出现在SA浓度为1.0和0.5 mmol·L-1(第3和第7天),分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加16.06%和11.44%;可溶性蛋白含量最大值则分别出现在SA浓度为1.5和1.0 mmol·L-1(第3和第7天),分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加14.13%和7.92%;游离脯氨酸含量最大值均出现在SA浓度为0.5 mmol·L-1,较单一300 mg·kg-1Cd处理分别增加了111.38%和311.39%(第3和第7天)。表明不同浓度外源SA处理后,三个指标值的变化具有时间和浓度效应,在较佳处理浓度下,处理第1天主要通过增加可溶性糖和游离脯氨酸含量进行渗透调节,处理第3天时,可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸三者均发挥调节作用,至处理第7天,主要由可溶性糖和游离脯氨酸,尤其是游离脯氨酸完成渗透调节作用。说明绵毛水苏缓解Cd胁迫的渗透调节机理主要是通过增加可溶性糖含量以及大幅度增加游离脯氨酸含量来完成的。

外源喷施GSH处理第1、第3和第7天,绵毛水苏叶片可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均随着GSH浓度增加呈先升高后降低的趋势。其中,可溶性糖含量的最大值按时间节点依次出现在GSH浓度为0.3、0.2和0.3 mmol·L-1(处理第1、第3和第7天,下同),分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加7.67%、4.50%和50.28%;可溶性蛋白含量最大值均出现在GSH浓度为0.3 mmol·L-1,分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加2.05%、3.98%和12.77%;游离脯氨酸含量最高值分别出现在GSH浓度为0.2、0.2和0.1 mmol·L-1,分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加134.23%、110.95%和313.77%,且各处理游离脯氨酸含量均高于相应时间的CK。表明外源喷施GSH处理缓解Cd胁迫的渗透调节主要通过大幅度增加游离脯氨酸含量来完成,处理第7天时可溶性糖和可溶性蛋白也发挥一定的调节作用。

2.2.2 外源SA和GSH对Cd胁迫下绵毛水苏抗氧化酶的影响 如图5～6所示,与CK相比,单一300 mg·kg-1Cd处理下,绵毛水苏幼苗的SOD、POD、CAT活性显著升高,且均随处理时间延长呈上升趋势,3种酶活性增幅最高依次达54.00%、105%和80.00%。

外源喷施SA处理第1、第3和第7天,随着处理浓度升高,SOD、POD、CAT活性均呈先升高后降低趋势。其中,SOD和POD活性最大值均出现在SA浓度为1.5 mmol·L-1,且其SOD活性分别较单一300 mg·kg-1Cd处理提高57.39%、37.84%和10.49%(处理第1、第3和第7天,下同),POD活性分别升高11.28%、45.11%和85.00%;而CAT活性最大值依次出现在SA浓度为1.0、1.5和1.5mmol·L-1,分别较单一300 mg·kg-1Cd处理提高17.86%、27.85%和38.51%。此外,除2.0 mmol·L-1SA处理第1天时POD活性略低于单一300 mg·kg-1Cd处理外,其余处理POD活性均高于单一300 mg·kg-1Cd处理。表明1.5 mmol·L-1SA处理第1天,酶促清除体系中活性氧的清除主要由SOD承担,处理第3天3种酶的活性均较高,共同参与活性氧自由基的清除,而处理第7天则主要由POD完成,同时CAT也具有重要作用。

外源喷施GSH处理第1、第3和第7天,SOD、POD和CAT活性均随着处理浓度升高呈先升高后降低的趋势。其中,SOD活性最大值均出现在GSH浓度为0.3 mmol·L-1,分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加30.23%、60.77%和7.92%(处理第1、第3和第7天,下同);POD和CAT活性最大值均依次出现在GSH浓度为0.3、0.3和0.2 mmol·L-1,POD活性分别较单一300 mg·kg-1Cd处理增加10.50%、26.81%和15.28%,CAT活性分别增加35.39%、30.73%和50.21%。此外,除0.4mmol·L-1处理的SOD活性、0.4 mmol·L-1处理第1和第7天的POD活性、0.1 mmol·L-1处理第1和3天的CAT活性略低于单一300 mg·kg-1Cd处理外,其余处理酶活性值均显著高于单一300 mg·kg-1Cd处理(P＜0.05)。表明0.3 mmol·L-1GSH处理第1天,酶促清除体系中活性氧的清除主要由SOD和CAT共同承担,第3天主要由SOD完成,且POD和CAT也具有重要作用,而第7天则由CAT发挥主要作用。

2.3 外源SA和GSH对Cd胁迫下绵毛水苏体内Cd含量的影响

由表2可知,单一300 mg·kg-1Cd胁迫下,绵毛水苏地下部和地上部Cd含量显著增加(P＜0.05),且根部Cd含量远高于地上部。外源SA对地上部和地下部Cd含量无显著影响(P＞0.05),Cd迁移系数在0.024～0.030之间,表明Cd从地下部转移至地上部的转运系数均较低。GSH在一定程度上抑制了绵毛水苏对Cd的吸收,且随着处理浓度的增加,地上部和地下部Cd含量均呈先降低后升高的趋势,最小值均出现在GSH浓度为0.2 mmol·L-1,地上部和地下部Cd含量较单一300 mg·kg-1Cd处理分别减少43.01%和12.90%。GSH处理下Cd迁移系数为0.017～0.026,低于单一300 mg·kg-1Cd处理。表明GSH可能抑制了地下对Cd的吸收以及由地下部到地上部的转运。

3 讨论

3.1 外源SA和GSH对Cd胁迫下植物生长和渗透调节生理的影响

植物处于重金属Cd严重胁迫时,会出现叶片黄萎、老叶褪绿、卷曲,植株生长逐渐减缓[20-21]等现象。外源物质SA[22-23]、GSH[24]处理,可以缓解重金属对植物的损伤,提高植物的干物质积累量,但也有SA未缓解重金属胁迫的报道[25]。本研究发现,300 mg·kg-1Cd胁迫造成了绵毛水苏植株矮小、叶片脱水发黄,生物量降低等危害,使其生长受到严重的抑制,外源喷施SA和GSH处理均可以使绵毛水苏生长得到一定程度复苏。

从渗透生理调控物质和机理分析,Cd胁迫会诱导植物体内ROS大量积累,而植物往往会通过迅速积累可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等渗透调节物质,维持渗透平衡[26-27]。可溶性糖能有效地提高细胞渗透浓度[28],可溶性蛋白含量与细胞的保水能力、结构稳定性和整体性密切相关[29]。重金属胁迫下,可溶性蛋白质可与Cd2+形成Cd结合蛋白(Cd-BP),提高功能蛋白的数量,增加细胞渗透势。脯氨酸在维持细胞渗透压,保持细胞膜结构和功能的完整性,清除活性氧自由基,调节细胞氧化还原电势等方面具有重要作用[30]。有研究表明外源SA和GSH可促进可溶性糖含量增加以及金属硫蛋白和类金属蛋白与Cd发生螯合作用[31],并可大幅度提高游离脯氨酸含量[32-33],从而缓解重金属胁迫[5,34]。本研究发现,外源喷施SA处理后,可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量的变化具有时间和浓度效应,缓解绵毛水苏Cd胁迫的渗透调节机理主要通过可溶性糖和游离脯氨酸含量的大幅度增加来完成;而外源喷施GSH处理后,缓解Cd胁迫渗透调节机理主要由游离脯氨酸完成,长时间胁迫条件下(7 d),可溶性糖和可溶性蛋白,尤其是可溶性糖也发挥了重要作用。虽然SA和GSH均对绵毛水苏渗透调节具有重要的调控作用,但其作用机理不同。

3.2 外源SA和GSH对Cd胁迫下植物抗氧化酶活性的影响

SOD、POD和CAT是植物抗氧化系统中酶促清除自由基体系的主要酶,SOD能催化超氧阴离子自由基(O2-·)发生歧化作用而转化为H2O2和O2,POD可利用愈创木酚作为电子供体清除H2O2,植物体内的末端氧化酶CAT可把H2O2转变为H2O和O2,三者协同作用能有效清除植物体内自由基和过氧化物。植物受到胁迫时,会通过提高体内的SOD、POD和CAT活性来清除过多的ROS[35],防止植物遭受氧化伤害。外源SA[5,10]、GSH[34,36]处理在一定程度上能提高逆境胁迫下植株体内的SOD、POD和CAT活性,但3种酶活性的增加幅度受植物体内金属螯合肽的合成[37]、重金属配位结合[38]等的影响。本研究发现,外源喷施1.5 mmol·L-1SA处理后第1天,酶促清除体系中ROS的清除主要由SOD承担,第3天3种酶的含量均较高,共同参与ROS自由基的清除,而第7天则主要由POD完成,同时CAT也具有重要作用,体现3种酶具有协同作用效应;GSH处理后,3种酶也具有协同作用效应,外源喷施后第1天,活性氧的清除主要由SOD和CAT共同承担,第3天主要由SOD完成,POD和CAT也具有重要作用,而第7天则由CAT发挥主要作用。表明外源SA和GSH缓解Cd对绵毛水苏毒害的酶促清除机理是不同的,可能与二者诱导渗透调节生理物质的含量差异相关,物质含量差异是否受脯氨酸含量与金属螯合肽的合成、重金属配位结合以及可溶性蛋白含量增加等的影响,有待进一步研究。

3.3 外源SA和GSH对Cd胁迫下植物重金属吸收、运输和积累的影响

植物对重金属的吸收、运输和积累等过程与重金属对植物的毒害作用密切相关。根是植物吸收和积累Cd2+的主要器官。从Cd2+在植物体内的转运路径来看,Cd2+从根表面转运到达根部内皮层,然后经过导管转移至地上部。根细胞壁是Cd2+跨膜进入细胞质的第一道屏障,细胞壁带有丰富的负电基团,可通过吸附、络合、沉淀等作用阻控Cd2+进入细胞内部。质膜表面的强负电性会大量吸附带正电荷的Cd2+,影响Cd2+的跨膜运输以及质膜本身对Cd2+的敏感性,是Cd2+进入植物细胞内的天然屏障。根部细胞壁和质膜的屏障作用使得大多数植物将Cd2+富集在根部以减轻对地上部器官的伤害[39]。有研究发现,外源喷施SA对植株Cd2+的富集量无明显影响[13,39],但也有SA能减少植物对Cd2+的吸收,抑制Cd2+从地下部向地上部的转运的报道[40]。本试验发现,SA处理对绵毛水苏的Cd2+含量无明显影响,其原因是否与Cd2+在绵毛水苏体内的转运路径未受影响有关,有待进一步研究。GSH是形成植物螯合肽金属螯合肽的前体物质[41],可以促进根系金属螯合肽的合成[42],增加与Cd的螯合,并通过转运蛋白,将这些螯合物转运到胞外,或储存在液泡等细胞器内[43],减少向地上部的转移[16,23]。本试验发现,单一300mg·kg-1Cd胁迫下,绵毛水苏根地下部的Cd含量达131.25μg·g-1,约为地上部的35.96倍,表明Cd主要积累在绵毛水苏地下部,而GSH处理下由地下部到地上部的转运系数较低(0.017～0.026),向地上部转运的Cd减少,其原因是否是GSH促进植物螯合肽的合成,增加与Cd的螯合,或者是Cd从地下部表面到达内皮层的运输途径产生变化,导致可转运到地上部的Cd量减少,有待进一步研究。

4 结论

综上可知,外源SA、GSH处理促进了Cd胁迫下绵毛水苏地上部的生长,提高了游离脯氨酸含量以维持细胞渗透平衡,提高了抗氧化酶活性,外源GSH还能抑制植株对Cd的吸收和转运。表明SA、GSH对绵毛水苏具有缓解Cd胁迫的作用,且二者较佳的缓解浓度分别为:SA 1.0～1.5 mmol·L-1、GSH 0.3～0.4 mmol·L-1。在严重Cd污染区域种植绵毛水苏时,可以通过喷施外源SA、GSH来提高绵毛水苏的耐受能力。