液相串联质谱法测定饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考

◆作者：庄姜云 唐媛媛 吴永盛

◆单位：湛江市海关技术中心食品实验室

关键字：饲料；氯霉素；甲砜霉素；氟苯尼考；液相色谱串联质谱

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素属于氯霉素类抗生素，因对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很强的活性，而表现出广谱的抗菌能力（冯民等，2013）。重的毒副作用，会引起再生障碍性贫血和灰婴综合症等（李俊锁等，2002；丁全福等，2001；李佩佩等，2013），因此许多国家和地区禁止此类药物用于食品和饲料中。氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟苯尼考（FF）属于酰氨醇类药物，曾被广泛地用于动物各种传染性疾病的预防和治疗（肖国军等，2018）。多国已禁止氯霉素在动物疾病防治上的使用，尤其是食品动物。2019 年12 月27 日，氯霉素被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单（农业农村部公告第250 号）。饲料一般是兽药添加的主要载体，开展饲料中氯霉素类药物检测是从源头进行控制的有效方法，因此研究饲料中氯霉素类药物检测的方法具有重要意义。

由于饲料样品成分复杂，基质干扰物多，液相色谱- 质谱联用法在排除干扰、准确实现定性、定量分析方面更具优势。本研究以罗非鱼饲料为样品，建立了一种快速、简便、步骤简单，同时检测饲料中3 种酰胺醇类抗生素含量的LC-MS/MS 法，以便对食品动物用饲料进行有效监控，从而进一步确保动物源性食品的安全。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液质联用仪1290+G6400 系列三重四极杆质谱，配ESI 离子源（美国安捷伦公司）；Anke TDL-5-A,Anke LXJ-ⅡB 离心机（中国培英公司）；氮吹仪（美国Biotage 公司）；涡旋混匀器XH-B（天翎公司）。

甲醇、乙腈均为色谱级（美国fisher 公司），乙酸乙酯、正己烷均为分析纯（广州化学试剂厂产品），氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均购买Dr.Ehrenstorfer 公司,纯度99.0%以上，氘代氯霉素（d5- 氯霉素）,100μg/mL,1mL 购买Bepure，实验用水符合GB/T 6682 规定的二级用水。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

标准储备液：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考标准准备溶液（500mg/kg）分别称量经折算相当于12.5 mg（精确到0.1 mg）的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考标准物质，用甲醇溶解并定容于25mL 容量瓶中。氯霉素（10mg/kg）、甲砜霉素和氟苯尼考（100mg/kg）第一标准中间液，准确吸取0.5mL氯霉素标准储备液、5mL 甲砜霉素、5mL 氟苯尼考标准储备液（500mg/kg）于25mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。氯霉素（1.0mg/kg）、甲砜霉素和氟苯尼考（10.0mg/kg）第二标准中间液，准确吸取1.0mL 第一标准中间液于10mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配成第二标准中间液。

氯霉素(10μg/kg)，甲砜霉素和氟苯尼考（100.0μg/kg）混合标准工作溶液：准确吸取0.25mL第二标准中间液于25mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。准确移取上述标准工作溶液配成氯霉素0，0.1μg/kg，0.2μg/kg，0.5μg/kg，1.0μg/kg，2.0μg/kg,4.0μg/kg；甲砜霉素和氟苯尼考0，1.0μg/kg，2.0μg/kg，5.0μg/kg，10.0μg/kg，20.0μg/kg，40.0μg/kg的基质标准曲线。

氘代氯霉素（d5- 氯霉素）内标标准储备液（4.0mg/kg），准确吸取1.0ml 氘代氯霉素（d5- 氯霉素）标准溶液于25ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。氘代氯霉素（d5- 氯霉素）内标标准工作溶 液（40μg/kg），准 确 吸 取0.25mL 内标标准储备液于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.2.2 液相色谱- 串联质谱条件

1.2.2.1 色谱条件

色谱柱Agilent Eclipse XDBC18 柱，4.6 ×150mm， 粒 度5μm；进 样 量5.0μL；柱 温30℃；流速：600μL/mL；流动相：溶剂A 为纯水，溶剂B 为甲醇，主要液相流动梯度洗脱见表1。

1.2.2.2 质谱条件

离子化方式：ESI, 负离子检测；监测方式：MRM；GAS Flow：7L/min；GAS Temp325℃；Nebulize45 L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速10 L/min，定量为内标法，主要质谱参数见表2。

1.2.3 样品前处理

称取粉碎后的样品2g（精确至0.01 g）至50mL 离心管中，加入内标标准工作液100μL，加入5mL 乙酸乙脂，震荡15min，超声提取15min，4500r/min 离心1 0min，移取5mL 上清液于玻璃试管中。再加入5mL 乙酸乙脂提取，震荡15min，超声提取15min，4500r/min 离心10min，合并上清液于玻璃试管中。在45℃下氮气吹干，残渣用2.0mL 甲醇水溶液（3∶7）溶解，震荡1min，加入4mL 正己烷脱色脱脂，4500r/min 离心5min，移取下清液于1.5mL 塑料离心管中，在10000r/min 下离心5 min，取清液经0.22μm 滤膜过滤后上机测定。

表1 液相流动相梯度洗脱

表2 质谱参数

2 结果与讨论

2.1 方法的线性关系

拿罗非鱼饲料作为基质配制系列的混合标准溶度，氯霉素的溶度范围为0、0.1μg/kg、0.2 μg/kg 、0.5 μg/kg 、1.0 μg/kg 、2.0μg/kg、4.0μg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考的溶度范围为0、1.0μg/kg、2.0 μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0μg/kg、40.0μg/kg，其中CAP-D5 的溶度为4.0mg/kg，以溶度为横坐标，以响应值为纵坐标进行线性回归，其线性关系好，相关系数＞0.999，结果见表3。

2.2 方法的回收率和精密度

选择一份罗非鱼饲料样品进行加标回收率和精密度试验，样品分别添加氯霉素0.1μg/kg、0.2μg/kg和0.5μg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考1.0μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg 的混合标准液各6 份摇匀、静置20 min 后按1.2.3 方法处理并进行分析，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表4，可以看出，各个水平的回收率范围为94.8%～121.2%，RSD 为3.9%～9.4%，方法的准确度与精密度均满足对饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的方法检测要求。

2.3 前处理的优化

现行国标方法中要固相萃取净化、提取净化步骤多，消耗时间长，所以本方法用乙酸乙酯提取，全转移，正己烷脱色脱脂，目标物回收率好，精密度高，步骤简单，操作方便，节约成本，适合大批量的饲料检测。

2.4 流动相的选择

以0.1%甲酸水- 甲醇，乙腈- 水，0.1%甲酸水- 乙腈，甲醇- 水来做为流动相比较，流动相甲醇- 水的响应值比较高，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考分离效果好，灵敏度高。

表3 3 种化合物的线性回归方程、线性关系和线性范围(n=6)

表4 3 种化合物的加标回收率和精密度

3 结论

本文建立饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的液相色谱串联质谱的方法，该方法优化仪器条件和前处理的净化步骤，该前处理快速、简便、节约成本。具有回收率好、精密度和灵敏度高等优点，该方法完全适合现行的检测要求。