高盐饮食激活肠JAK1/STAT3通路诱导肠上皮屏障功能障碍

李晨 李晓媚 刘亭 雷超 刘聪 刘志华

广州医科大学附属第五医院前沿医学交叉研究中心，广州市加速康复腹部外科重点实验室，广州医科大学附属第五医院肛肠科（广州510700）

高盐被认为是高血压和心血管疾病的最常见危险因素之一。有研究［1-3］表明，高盐饮食可促进肠道炎症性疾病的发生发展，已知高盐饮食不但会影响肠道菌群组成，促进肠道炎症因子的表达，还会加重小鼠结肠炎症状。研究［4］还发现长期的高盐、高糖和高蛋白质饮食与炎症性肠病（IBD）发病率增加具有显著相关性［5-6］，高盐或高脂饮食可能会破坏肠屏障，从而导致全身炎症，肠屏障功能障碍是肠道疾病的重要特征，近期已有研究通过脑-肠轴将高盐与肠道菌群联系起来［7］，但高盐饮食诱导肠功能损伤的机制尚未完全清楚。

Janus 激酶/信号转导及转录激活因子（janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）通路是众多细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程［8-9］。实际上，由细胞因子引发的大多数免疫反应都依赖于STATs［10-11］。已有批准或正在研究抑制JAK/STAT 信号通路的抑制剂作用于IBD的治疗［12-20］，JAK/STAT 抑制剂在IBD 的小鼠模型中显示了与阻断多种自身免疫途径一致的强大疗效［21］。高盐饮食是否通过激活JAK/STAT 通路诱导肠屏障功能障碍的机制尚未明确，因此，本研究通过制备高盐饮食小鼠模型，检测各组结直肠组织的肠屏障蛋白和JAK/STAT 通路蛋白的改变，并进行相关性分析。此外，在细胞水平上，采用高浓度NaCl 对人正常结肠上皮细胞NCM-460 细胞进行处理，观察高浓度NaCl 对肠细胞的肠屏障蛋白和JAK/STAT 通路蛋白的影响，进一步验证高盐是否能激活JAK/STAT 通路，并降低肠屏障紧密连接蛋白的表达，即引起肠屏障功能障碍。

1 材料与方法

1.1 主要试剂JAK1抑制剂Ruxolitinib，购于Sigma公司；兔抗ZO-1、β-actin 抗体购于艾博抗公司；鼠抗Occludin 抗体购于Proteintech 公司；兔抗JAK1、P-JAK1、STAT3、P-STAT3 抗体购于Cell Signaling TECHNOLOGY，CST 公司；DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）购于Gibco 公司；DMSO，戊巴比妥钠，购于Sigma 公司；脱脂奶粉购于伊利公司；吐温20购于天津科密欧化学试剂厂；无水乙醇购于广州市番禺力强化工；BCA Protein Assay Kit、蛋白maker 购于Thermo Scientific；5×loading buffer、一抗稀释液购于上海碧云天生物公司；细胞培养皿、离心管购于Corning 公司。

1.2 模型制备与分组

1.2.1 动物实验体质量为（20 ± 5）g 的SPF 级健康雄性C57BL/6 小鼠购于广东省实验动物中心［合格证号为：SCXK（粤）2018-0002］；小鼠适应性喂养一周后，随机分组，每组5 只，组别为正常饮食对照组（control）、高盐饮食组（high salt diet，HSD），正常饮食对照组按照常规饲养方法，高盐饮食组采用高盐特制饲料（NaCl 成分为8%）饮食12 周。两组小鼠予以自由饮食、饮水、予同等的光照时间，昼夜比12 h∶12 h，实验终点未出现小鼠死亡，喂养12 周后小鼠分别予1.5 % 戊巴比妥钠麻醉处死，开腹取出结肠组织，迅速收集所需数据，立即放入预先做好标记的冻存管中并放入液氮，再进行-80 ℃冻存。

1.2.2 细胞实验采用人正常结肠上皮细胞NCM-460 细胞进行细胞实验，设计组别：（1）正常对照组（control）；（2）高浓度NaCl组（high NaCl，50 mmol/L）；（3）高浓度NaCl+JAK1 抑制剂共孵育组high NaCl（50 mmol/L）+ Ruxolitinib（50 μmol/L），然后收集细胞进行后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白提取和样品制备在收集好的结直肠组织，或处理过的肠细胞置于冰上，加入适量体积的含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解，结直肠组织在组织破碎仪的作用下制备成样品匀浆液，4 ℃离心10 000 ×g，10 min。收集样品上清液，然后取少量上清液，采用BCA Protein Assay Kit 检测样品的蛋白浓度，剩余上清液做后续实验。

1.3.2 Western blot 实验每个样本取30 μg 蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白，电转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4 ℃下摇晃过夜，加辣根过氧化酶（HRP）标记二抗，室温孵育2 h，最后行ECL化学发光法显色，用凝胶成像系统（chemiDoclM xRs+system，Bio-Rad）采集图像，用Image-Pr0 Plus软件进行灰度扫描。

1.3.3 口服糖耐量的测定先将两组禁食12 h 后经尾静脉采血测定空腹血糖值（blood glucose，BG），然后一次性灌胃给予40%葡萄糖溶液（2 g/kg），分别在灌胃后30、60、90 和120 min 检测血糖值，绘制血糖-时间曲线，并采用梯形法计算曲线下面积（area under the curve，AUC），AUC（mmol/L·min）=1/2 ×（BG 0 min + BG 30 min）× 30 min + 1/2 ×（BG 30 min+BG 60 min）×30 min+1/2×（BG 60 min+BG 90 min）×30 min+1/2×（BG 90 min+BGl 20 min）×30 min。

1.4 统计学方法数据用（x±s）表示，采用SPSS 16.0 统计学软件对数据进行分析处理，采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高盐饮食对小鼠的体质量和肠道的代谢影响高盐饮食12 周后，与正常饮食对照组相比，高盐饮食组小鼠不仅体质量显著降低（P＜0.05），结直肠的肠重量和肠长度也都显著降低（表1）；此外，12 周的高盐饮食还诱导了小鼠的糖耐受异常，在口服糖耐量试验测得糖负荷60、90 和120 min 时间点的血糖浓度均显著高于正常饮食对照组（P＜0.01，图1 A），并且计算所得的血糖-时间曲线下面积（AUG）也明显增加（P＜0.01，图1 B），这些结果提示，高盐饮食可诱导小鼠的体重和肠道等体内代谢异常。

表1 高盐饮食小鼠模型的各项指标结果Tab.1 Results of various indicators in a mouse model of high-salt diet ± s

表1 高盐饮食小鼠模型的各项指标结果Tab.1 Results of various indicators in a mouse model of high-salt diet ± s

注：control 组为正常饮食对照组，HSD 组为高盐饮食组，*P ＜0.05 vs. 正常饮食对照组（control）

组别control 组HSD 组体质量（g）23.80 ± 0.90 18.90 ± 2.20*结直肠重量（g）0.196 3 ± 0.01 0.169 3 ± 0.01*结直肠长度（cm）8.10 ± 0.23 7.50 ± 0.21*

2.2 高盐饮食对小鼠肠屏障功能的影响肠上皮屏障主要由细胞间的紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1 等）、下端粘附连接和细胞桥粒等形成的机械屏障，调控肠道通透性，使得跨细胞物质运输保持动态平衡，所以紧密连接蛋白的表达量是衡量肠屏障功能的重要指标之一。通过Western blot 实验检测两组小鼠肠组织中的紧密连接蛋白表达量，结果显示，相对于正常饮食对照组，高盐饮食组小鼠的结直肠组织的紧密链接蛋白ZO-1 和Occludin蛋白表达均明显降低（P＜0.05，图2），结果提示高盐饮食可降低肠组织的紧密连接蛋白，影响小鼠肠屏障功能。

图l 两组小鼠口服糖耐量试验结果Fig.1 Results of oral glucose tolerance test in two groups of mice

2.3 高盐饮食对小鼠结直肠组织JAK1/STAT3 通路蛋白的影响本实验检测了两组小鼠肠组织中的JAK1/STAT3 通路蛋白表达量，结果显示，相对于正常饮食对照组，JAK1/STAT3 通路中的p-JAK1磷酸化蛋白明显升高（P＜0.05），p-STAT3 磷酸化蛋白也具有明显的增加趋势（P＞0.05），结果表明高盐饮食可激活肠组织JAK1/STAT3 通路。见图3。

2.4 高浓度NaCl 对人正常结直肠上皮细胞JAK1/STAT3 通路的影响为了进一步验证高盐是否直接诱导了肠道JAK1/STAT3 通路激活，采用高浓度NaCl（50 mmol/L）孵育处理人正常结直肠上皮细胞NCM-460 细胞48 h，然后经过Western blot 实验发现，与正常对照组相比，高浓度NaCl 可诱导p-JAK1磷酸化蛋白显著升高（P＜0.05），p-STAT3 磷酸化蛋白表达显著增多（P＜0.001），即JAK1/STAT3通路蛋白的磷酸化水平上升；但采用JAK1 抑制剂Ruxolitinib 共孵育48 h 后，该作用可被JAK1 抑制剂逆转。这些结果表明，高浓度NaCl 可直接激活肠道JAK1/STAT3 通路。见图4。

2.5 高浓度NaCl 对人正常结直肠上皮细胞肠屏障紧密连接蛋白的影响在高浓度NaCl 孵育处理人正常结直肠上皮细胞实验中，与正常对照组相比，高浓度NaCl 除了可激活JAK1/STAT3 通路外，也显著地降低了肠屏障紧密连接蛋白ZO-1 和Occludin 的表达（P＜0.05）；但是采用JAK1 抑制剂Ruxolitinib 与高浓度NaCl 共同孵育48 h 后，与高浓度NaCl 处理组相比，JAK1 抑制剂可使ZO-1和Occludin 的蛋白表达恢复至正常对照组的水平（P＜0.05）。综上结果表明，高浓度NaCl 可通过激活JAK1/STAT3 通路诱导肠屏障蛋白表达受损。见图5。

注：A，结直肠组织紧密连接蛋白电泳条带；B，紧密连接蛋白ZO-1 的蛋白相对表达量；C，紧密连接蛋白Occludin 的蛋白相对表达量；control 组为正常饮食对照组，HSD 组为高盐饮食组，*P ＜0.05，**P ＜0.01 vs. 正常饮食对照组（control）

图3 各组小鼠的结直肠组织JAK1/STAT3 通路蛋白Fig.3 JAK1/STAT3 pathway protein in colorectal tissue of each group of mice

图4 高浓度NaCl 对人正常结直肠上皮细胞JAK1/STAT3 通路的影响Fig.4 The effect of high concentration NaCl on JAK1/STAT3 pathway in human normal colorectal epithelial cells

3 讨论

当肠屏障紧密连接蛋白遭到破坏，肠上皮屏障功能障碍会导致肠通透性增加，随后是有毒代谢物或管腔促炎分子的渗透，导致持续的炎症和组织损伤，炎症性肠病IBD 患者中表现出肠细胞旁通透性增。高盐饮食诱导免疫细胞在肠道中积累，促炎性细胞因子增加，严重还可加剧神经炎症［22］，并引起血管神经认知功能障碍［23-25］。作为人体重要防线的肠上皮屏障，具有防止肠内高负荷的细菌和毒素穿过肠粘膜进入人体血液循环的重要作用。因此，研究诱发肠屏障功能障碍的机制，可为社会提供针对肠道疾病的有效治疗和预防方法。肠道作为食物吸收的重要器官，饮食习惯对肠道屏障功能的影响最大，而近年来也越来越多的研究发现高盐饮食与慢性肠炎，肠易激等都密切相关。本研究发现连续12 周高盐饮食明显抑制肠道组织的屏障蛋白ZO-1 和Occludin的表达，并且降低结直肠的重量和长度，提示肠道功能受损。WILCK 等［26］也曾报道过中度高盐饮食可导致人体高血压，伴有肠菌紊乱和肠道过度免疫性损伤，并且高血压患者血清中肠道脂肪酸结合蛋白（I-FABP）、连蛋白（肠道上皮紧密连接蛋白调节因子）以及脂多糖LPS 等都显著升高，该结果是对本研究高盐饮食诱导小鼠肠道屏障功能障碍的有力佐证，但其中的机制尚未明确。

图5 高浓度NaCl 对人正常结直肠上皮细胞肠屏障紧密连接蛋白的影响Fig.5 The effect of high concentration of NaCl on tight junction protein of intestinal barrier of human normal colorectal epithelial cells

JAK/STAT 通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。本研究除了发现高盐饮食激活了小鼠肠组织JAK/STAT 通路和损伤肠屏障功能外；在肠上皮细胞实验中也发现，高浓度NaCl 也显著增加了JAK1 和STAT3 的磷酸化，并降低细胞的肠屏障蛋白表达，但是这些作用可被JAK 抑制剂阻断，恢复肠细胞的屏障蛋白表达。DENG 等［27］在脑部星形胶质细胞实验中也报道过相似结果，高盐环境可刺激星形胶质细胞的STAT3 磷酸化增加，使用JAK 抑制剂则阻断高盐对STAT3 的磷酸化作用；LOPERENA等［28］也在具有高盐饮食习惯的高血压患者的主动脉内皮细胞中，发现STAT3、STAT5 磷酸化被激活；还有研究在大鼠肠道缺血再灌注损伤模型的研究中发现，肠组织的JAK/STAT 通路激活并伴有肠上皮细胞凋亡，使用右美托咪或小檗碱处理抑制JAK/STAT 通路活性后，可显著减轻肠道缺血损伤及肠上皮细胞凋亡［29-31］。以上国内外研究结果从侧面佐证了本研究提出“高盐环境可能通过激活JAK1/STAT3 通路蛋白磷酸化诱导肠屏障功能障碍”的观点。

综上所述，本研究通过高盐环境的动物模型和细胞模型，揭示了高盐饮食损伤肠上皮屏障功能障碍的机制与JAK1/STAT3 通路激活密切相关，此外还发现JAK1 抑制剂具有治疗高盐诱导的肠上皮屏障功能障碍的作用，为治疗肠道疾病提供新的辅助治疗靶点、药物和预防方法。