去泛素化酶抑制剂Au（PPh3）PT对胃癌细胞活力和凋亡的影响及机制

张培全 黄擎天 龙惠丹 李小芬

广州医科大学广东省蛋白质修饰与降解重点实验室（广州511436）

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别为全球恶性肿瘤的第五位和第三位［1］。在我国胃癌患者总体5年生存率不足50%［2］，化疗作为晚期胃癌最常用的治疗手段之一［3-4］，发挥了重要作用，但存在许多不良反应［5-7］，迫切需要开发其他抗胃癌药物。Au（PPh3）PT 为实验室研发合成的一价金离子化合物，已被证实可以有效抑制多种去泛素化酶（deubiquitinase，DUB），是一种潜在的抗肿瘤药物［8］。本研究旨在探索Au（PPh3）PT 能否有效诱导胃癌细胞的毒性作用，为胃癌的治疗提供新的药物选择。

1 材料与方法

1.1 实验细胞人胃癌细胞系MGC-803 和SGC-7901 由广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所惠赠，均来源ATCC 细胞库。

1.2 实验药品与试剂RPMI-1640 培养基和胎牛血清购自Gibco；MTS 试剂盒购自Promega；抗caspase-3、抗caspase-8、抗caspase-9、抗cleaved caspase-8 及抗PARP 抗体购自Cell Signaling Technology；抗K48-、抗GAPDH、抗cleaved caspase-3 和抗cleaved caspase-9 抗体购于Bioworld Technology；Annexin V - fluoroisothiocyanate （FITC）/propidium iodide（PI）试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；ECL 发光试剂盒、抗Ub 抗体、辣根酶标记山羊抗兔/抗鼠IgG 购自Santa Cruz；其他生化试剂为进口分装或国产分析纯。

1.3 实验仪器Varioskan Flash 酶标仪（美国Thermo 公司）；荧光倒置显微镜（德国ZEISS 公司）；HERA cell 150i 细胞培养箱（美国Thermo 公司）；Accuri C6 流式细胞仪（美国BD FACSAria 公司）；5810R 离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.4 检测方法

1.4.1 细胞培养细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。

1.4.2 MTS 法测定细胞活力收集细胞，调为1 ×105个/mL 细胞悬液，每孔100 μL，接种到96 孔板，细胞培养24 h；弃掉旧培养液，加入新培养液（含1%的Au（PPh3）PT 药物溶液）100 μL，设DMSO 溶剂对照及空白对照组，分别作用24、48、72 h，加入20 μL MTS，避光培养2 ～4 h 后检测OD值，计算抑制率及IC50。

1.4.3 倒置荧光显微镜观察细胞凋亡将胃癌细胞消化、计数，制成2 × 105个/mL 的细胞悬液，接种到6 孔板，每孔2 mL，培养24 h；弃掉旧培养基，加入3 mL 含药物的新培养基，培养24 h；PBS 洗涤后每孔加入500 μL 的Binding Buffer，再依次加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 染色液，混匀，室温避光孵育15 min，倒置荧光显微镜拍照，记录细胞形态及荧光标记情况。

1.4.4 流式细胞术检测细胞凋亡细胞铺板、加药，培养24 h，PBS洗涤，用不含EDTA的胰蛋白酶溶液消化，PBS 洗涤，收集细胞；每管加入500 μL 的Binding Buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 染色液，混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.5 Western blot 检测蛋白水平细胞经消化、离心、PBS 洗涤后收集，蛋白裂解液裂解细胞，超声破碎仪破碎细胞。4 ℃，13 000 r/min，离心10 min，取上清，BCA 法测定蛋白浓度，将浓度调一致。SDS电泳法检测蛋白水平，10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；转膜，4 ℃冰浴，286 mA 恒电流150 min；将PVDF 膜完全浸入5%脱脂牛奶中，37 ℃平缓摇动1 h；封闭结束后加入一抗室温下孵育1 h；TBS/T漂洗后，将PVDF 膜浸入含8 mL 二抗的脱脂牛奶中，37 ℃摇动1 h；再用TBST 进行充分漂洗，最后采用ECL 化学发光法进行胶片曝光检测相关蛋白的变化。

1.5 统计学方法所有实验均独立进行3 次，GraphPad Prism 5.0 和SPSS 19.0 统计软件进行结果分析。数据均采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组间差异比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Au（PPh3）PT 对胃癌细胞活力的抑制情况Au（PPh3）PT 作用24、48、72 h 后，MTS 方法检测Au（PPh3）PT 对胃癌细胞活力的抑制情况，可见Au（PPh3）PT 明显抑制胃癌细胞的活力，呈浓度和时间依赖性，见图1。

图1 Au（PPh3）PT 诱导胃癌细胞活力的抑制Fig.1 Au（PPh3）PT inhibited the cell viability in gastric cancer cell lines

2.2 Au（PPh3）PT 引起胃癌细胞形态学的改变实验发现随着Au（PPh3）PT 浓度的增高，Annexin VFITC/PI 双染的阳性细胞数增多，并伴有典型的细胞形态学变化，表明Au（PPh3）PT 可以诱导胃癌细胞的凋亡，见图2。

图2 Au（PPh3）PT 导致胃癌细胞形态学的变化Fig.2 Au（PPh3）PT induced morphological changes in gastric cancer cell lines

2.3 Au（PPh3）PT 诱导胃癌细胞凋亡的情况为进一步确证Au（PPh3）PT 诱导胃癌细胞凋亡，采用流式细胞仪检测。结果表明随着Au（PPh3）PT 浓度的增高，细胞凋亡率增高，与溶剂对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），结果见图3。

图3 Au（PPh3）PT 诱导胃癌细胞的凋亡Fig.3 Induction of apoptosis in gastric cancer cell lines by Au（PPh3）PT

2.4 Au（PPh3）PT 引起胃癌细胞凋亡相关蛋白的变化免疫印迹结果显示Au（PPh3）PT 可以明显诱导胃癌细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9 前体减少，活化带增多；PARP 切割带出现，表明Au（PPh3）PT 导致胃癌细胞凋亡的机制与caspase 系统的激活有关，见图4。

图4 Au（PPh3）PT 诱导胃癌细胞凋亡相关蛋白的改变Fig.4 Au（PPh3）PT resulted in changes of the apoptosisrelated proteins in gastric cancer cell lines

2.5 Au（PPh3）PT 引起胃癌细胞泛素化蛋白的改变免疫印迹结果显示Au（PPh3）PT 明显引起胃癌细胞总的及K48-链接的多聚泛素化蛋白的聚集增加，表明Au（PPh3）PT 能够抑制胃癌细胞的蛋白酶体功能，见图5。

3 讨论

泛素-蛋白酶体系统（the ubiquitin-proteasome system，UPS）降解细胞内80%以上的蛋白［9］，不仅能清除错误的蛋白，还对细胞生长、DNA 修复等发挥重要作用［10-11］。UPS 功能障碍与多种疾病的发生发展密切相关，如神经退行性疾病、心血管系统疾病、病毒感染及肿瘤等［12-15］。多种肿瘤细胞蛋白酶体活性异常增高，表明这些肿瘤细胞比非肿瘤细胞更依赖UPS 来抵御细胞压力，靶向UPS 可以治疗多种肿瘤［16-18］。但靶向UPS 用于胃癌治疗的研究较少，效果不确切，需要更多研究证实［19-20］。

图5 Au（PPh3）PT 引起胃癌细胞泛素化蛋白的聚集增加Fig.5 Au（PPh3）PT induced increasing of ubiquitinated proteins in gastric cancer cell lines

蛋白酶体抑制剂分为20S 蛋白酶体抑制剂和DUB 抑制剂。硼替佐米是首个被美国FDA 批准用于临床治疗多发性骨髓瘤的20S 蛋白酶体抑制剂，取得了很好的疗效，但其耐药和副作用的问题有待解决［21-22］。与20S 蛋白酶体抑制剂相比，大部分DUB 抑制剂只针对一部分DUB，具有更好的特异性和选择性，用于肿瘤治疗具有重要意义［23］。DUB 抑制剂受到学者的高度关注，其应用前景非常广阔。但目前还没有用于临床治疗疾病的药物。

Au（PPh3）PT 为课题组研发合成的一价金离子化合物，研究证实其有效抑制19S 蛋白酶体相关DUB（UCHL5 和USP14）及胞浆内部分DUB（USP7，USP10，USP15，USP25）的活性［8］，是一个潜在用于抗肿瘤的DUB 抑制剂。笔者推测Au（PPh3）PT 或许可以抑制胃癌细胞的生长。本研究对Au（PPh3）PT 对肿瘤细胞活力的影响进行检测，发现Au（PPh3）PT 确实可以有效抑制胃癌细胞的活力，并呈现剂量和时间依赖性。形态学及流式细胞术结果显示Au（PPh3）PT 可使胃癌细胞凋亡率明显增加。以上表明Au（PPh3）PT 能够诱导胃癌细胞的毒性作用，是一个潜在的抗胃癌药物。

泛素分子有76 个氨基酸残基，其序列高度保守，全长包含7 个赖氨酸位点（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和1 个C 端的甘氨酸位点，其中48位赖氨酸链接（K48-）被认为与蛋白酶体降解有关［24-25］。本研究发现Au（PPh3）PT 可以使总的及48 位链接的泛素化蛋白大量聚集，表明Au（PPh3）PT 抑制了胃癌细胞UPS 活性。有报道［23］抑制肿瘤细胞的UPS 活性可诱导肿瘤细胞的凋亡，本研究结果也表明Au（PPh3）PT 通过抑制胃癌细胞UPS的活性从而诱导其凋亡。

Caspase-8 和caspase-9 是凋亡启动子，其中caspase-8 可以启动死亡受体介导的外源性细胞凋亡通路，而caspase-9 可以启动线粒体介导的内源性细胞凋亡通路，两者都可激活下游的凋亡效应子caspase-3，发生级联反应，使细胞凋亡［26］。本研究结果显示Au（PPh3）PT 可以明显引起caspase-3、caspase-8、caspase-9 前体减少，活化的切割带相应增多，表明Au（PPh3）PT 通过影响caspase 通路从而引起胃癌细胞凋亡。

综上所述，本研究对Au（PPh3）PT 对胃癌细胞的毒性作用及其机制进行探讨，研究发现Au（PPh3）PT 明显抑制胃癌细胞的活力并诱导其凋亡，机制与激活caspase 系统和抑制UPS 活性有关。本研究为DUB 抑制剂用于胃癌的治疗提供新的理论依据。本实验尚存诸多不足，如缺乏体内实验，后续有待进一步开展；同时更多的蛋白酶体抑制剂对胃癌的作用有待探索和比较，以期找出高效低毒的抗胃癌药物，改善胃癌患者的生存率和生存质量。