TGF-β1对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖的影响及可能的机制*

何仁颖，何 威，李航宇，张 斌,4△

1.中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院皮肤科，重庆 400037；2.重庆市人民医院皮肤科，重庆 400014；3.中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院烧伤科，重庆 400038；4.重庆市中医院/重庆市第一人民医院皮肤科，重庆 400011

皮肤鳞状细胞癌是一种来源于表皮角质形成细胞的常见恶性肿瘤，好发于颜面部，且随着时间的推移容易发生转移，严重影响患者的外貌及健康。随着环境污染的加重，鳞状细胞癌的发病率逐年升高。近年来研究表明，转化生长因子-β1(TGF-β1)在调节细胞生长、分化、凋亡和在维持皮肤内环境稳定方面均发挥着至关重要的作用，是重要的调节者和参与者[1]。既往研究发现，在人皮肤鳞状细胞癌组织中有TGF-β/Smad信号转导通路的存在，且其中几种TGF-β1受体的表达存在变化[2]。然而，TGF-β1的表达是否与人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖过程有关，相关报道甚少。为此，本研究通过观察A431细胞和HaCaT细胞在不同TGF-β1作用浓度和作用时间后，细胞的增殖情况和细胞中TGF-β受体mRNA表达的变化情况，来进一步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料来源 人角质形成细胞 HaCaT 细胞和人皮肤鳞状细胞癌A431 细胞均购于中国医学科学院上海细胞所。

1.2仪器与试剂 人重组 TGF-β1 (美国 PEPROTECH 公司)、胎牛血清(天津灏洋生物制品科技责任有限公司)、DMEM培养液(美国 Gibco公司)、胰蛋白酶和 Tripure Isolation Reagent(美国Roche公司)、SYBR®Premix Ex TaqTM和 PrimeScriptTMRT Reagent Kit(日本TaKaRa Bio公司)、DMSO(常州市科丰化工有限公司)、MTT试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。凝胶成像分析仪(美国Alpha Innotech公司)、荧光定量 PCR 反应扩增仪和酶标仪(Model 550 version 2.24，美国Bio-Rad公司)、DU800核酸/蛋白检测仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.3方法

1.3.1细胞培养及分组 将HaCaT 细胞和A431细胞以每孔5×103个接种于96孔板，在5% CO2，37 ℃的细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM液培养24 h至贴壁。按以下分组要求向细胞培养液中添加TGF-β1后换液培养：(1)浓度组，按TGF-β1终浓度0、5、10、20、100 ng/mL分为5组，持续作用48 h。(2)时间组，TGF-β1终浓度为20 ng/mL时，分别作用12、24、48、72 h。另设空白对照。每组设6个复孔，结果重复检测3次。

1.3.2MTT法检测TGF-β1对细胞增殖的影响 将50 μL MTT溶液加入各孔，继续培养4 h后弃上清液。加入DMSO液150 μL，充分震荡溶解后于490 nm处测定各孔吸光度值(A490 nm)，计算细胞活性率。

1.3.3RT-PCR测定TGF-β1对细胞中TGF-β受体mRNA表达的影响 分别将培养好的人皮肤鳞状细胞癌A431细胞和HaCaT细胞进行RNA提取，并对各自RNA样本的纯度和浓度进行检测。按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明中的具体操作步骤进行反转录反应。严格按照试剂盒操作说明配制相应的反应体系。扩增条件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法进行分析。

2 结 果

2.1相同作用时间下不同浓度的TGF-β1对细胞增殖的影响 在作用时间相同的情况下，不同浓度的TGF-β1对HaCaT细胞的增殖均能产生显著的抑制作用，见图1，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。而在不同浓度的TGF-β1对A431细胞的增殖无明显抑制作用，与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，这提示TGF-β1对A431细胞产生的抑制作用不明显。

图1 不同浓度TGF-β1对HaCaT细胞和A431细胞增殖的影响(MTT法)

2.2相同浓度的条件下TGF-β1不同作用时间对细胞增殖的影响 在TGF-β1浓度均为20 ng/mL的情况下，分别作用不同时间，TGF-β1对HaCaT细胞的增殖产生了明显的抑制作用，见图2，与对照组细胞相比，差异有统计学意义(P<0.05)。而TGF-β1对A431细胞增殖产生的抑制作用不明显，与对照组细胞相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图2 TGF-β1不同作用时间对HaCaT细胞增殖的影响

图3 TGF-β1不同作用时间对A431细胞增殖的影响

2.3TGF-β1对HaCaT细胞TGF-β受体mRNA表达的影响 在相同的作用时间下(均为48 h)，在一定浓度范围内，随着TGF-β1浓度的增加，HaCaT细胞的TGF-β受体Ⅰ mRNA(TGF-βRⅠ mRNA)、TGF-β受体Ⅱ mRNA(TGF-βRⅡ mRNA)的表达呈下降趋势，见表1。在TGF-β1浓度均为20 ng/mL时，HaCaT细胞TGF-βRⅠ mRNA、TGF-βRⅡ mRNA的表达随着TGF-β1作用时间的延长呈下降趋势，见表2。

表1 不同浓度TGF-β1对HaCaT细胞TGF-β受体mRNA表达的影响

表2 TGF-β1不同作用时间对HaCaT细胞TGF-β受体mRNA表达的影响

2.4TGF-β1对A431细胞TGF-β受体mRNA表达的影响 在作用相同48 h条件下，在一定浓度范围内，随着TGF-β1浓度的增加，A431细胞的TGF-βRⅠ mRNA、TGF-βRⅡ mRNA的表达逐渐下降，见表3。在TGF-β1浓度均为20 ng/mL的条件下，A431细胞中TGF-βRⅠ mRNA的表达在一定时间范围内，随着TGF-β1作用时间的延长逐渐下降，见表4。

表3 不同浓度TGF-β1对A431细胞TGF-β受体mRNA表达的影响

表4 TGF-β1不同作用时间对A431细胞TGF-β受体mRNA表达的影响

3 讨 论

TGF-β信号传导通路十分复杂，主要由TGF-β受体介导。TGF-β受体分为Ⅰ型受体(TGF-βRⅠ)、Ⅱ型受体 (TGF-βRⅡ) 和Ⅲ型受体(TGF-βRⅢ)[3]。经典的Smads信号通路主要是由TGF-β与TGF-βRⅡ的胞外段相结合后磷酸化激活TGF-βRⅠ，通过下游的Smad4蛋白完成TGF-β信号由细胞质转入细胞内的过程[4]。TGF-βRⅢ因结构上不含激酶活性区，故不直接参与信号转导，主要起调节的作用[5]。TGF-β/Smad信号途径异常与多种上皮来源的恶性肿瘤密切相关，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌及宫颈癌等肿瘤中均存在TGF-β的过度表达；在人的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、食管鳞状细胞癌(ESCC)和皮肤鳞状细胞癌中也存在TGF-β1过表达的情况[6]。TGF-β在肿瘤细胞中过度表达，不仅可以直接影响肿瘤细胞的浸润和转移，还能刺激血管生长，起到促进肿瘤发展的作用[7]。TGF-β 对肿瘤的直接影响可以通过Smads依赖途径或干扰Smads依赖途径介导完成，除经典的Smads信号通路外[8-9]，还有其他非经典的不依赖于Smads蛋白信号通路的交互作用，如MAPK信号通路，它包括 ERK、JNK、p38、MAP 激酶等[10-11]。

对于大部分上皮细胞来源的恶性肿瘤而言，TGF-β1主要通过抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞生长停滞和凋亡来发挥作用[3]。但也有研究者观察到，部分肿瘤细胞对TGF-β的抑制作用不敏感，可以逃避TGF-β介导的生长抑制作用，这可能与肿瘤细胞表面TGF-β受体的表达异常有关，同时，TGF-β 介导的抑制作用与TGF-βRⅠ或者TGF-βRⅡ的表达密切相关，在人类ESCC中，约53.8%的患者表现出TGF-βRⅠ的表达降低，这与肿瘤的侵袭深度、转移和病理分期有关[12]。在人小细胞肺癌细胞系中，HOUGAARD等[13]发现TGF-βRⅡ的表达明显降低。此外，编码TGF-β受体和Smads的基因耗竭或突变会导致小鼠模型自发性肿瘤的发生，且与人类癌症的不良存活率相关[14]。如果两种受体的表达存在缺陷，或者其中一种存在表达缺陷，就可能直接导致其抑制增殖的作用丧失。在HNSCC患者中也发现，在细胞恶性转化过程中，TGF-βRⅠ发生突变的概率较小，但70%以上的患者会出现TGF-βRⅡ表达的降低或消失[15]。TGF-βRⅡ耗竭可以使内源性TGF-β1的表达增加，由此产生的TGF-β1过度表达可能会增加血管生成和炎性反应，从而促进HNSCC中肿瘤的进展[14]。TGF-βRⅡ发生突变的概率较大，较多见。研究表明，在口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者中TGF-βRⅡ表达出现降低或消失，在晚期OSCC患者中，TGF-βRⅡ的E221V/N238I突变可增强TGF-β信号传导、导致更具侵入性的表型改变[16]。TGF-βRⅡ的缺陷与SCC的病情进展密切相关。

本研究也发现，在一定剂量和作用时间范围内，TGF-β1对HaCaT细胞增殖的抑制作用十分明显；而在A431细胞中，TGF-β1的抑制作用却不显著。当TGF-β1作用后，在A431细胞和HaCaT细胞中均出现了TGF-β受体mRNA表达水平的下降，说明与HaCaT细胞相比，TGF-β1对A431细胞的作用更加明显。TGF-β受体是TGF-β信号传导的必要条件，如果TGF-β受体表达水平下降或缺失，会导致TGF-β信号下传受阻。由此推测，A431细胞可能通过诱导TGF-β受体的表达下调，使得TGF-β信号下传受到阻碍，其抑制作用失效，使得表皮内环境稳态遭到破坏，导致皮肤肿瘤细胞的抑癌基因功能丧失，癌基因被激活，最终导致肿瘤的形成。