变异链球菌生长受枯草芽孢杆菌抑制机制的代谢组学分析

徐 洋 晁文池 宋宝莉 高江力

1 甘肃省兰州市中医医院 730000； 2 西北民族大学医学部

龋病是一种重要的口腔疾病，其不但会对牙体硬组织进行慢性破坏，而且还是消化系统疾病、心血管疾病、过敏性紫癜等多种全身性疾病的危险因素，同时，龋病也是人群中发病率最高的疾病之一[1]。相关研究已证实细菌是龋病的主要致病因素，其中变异链球菌(Streptococcus mutans)由于可在口腔中通过产生多种代谢产物发酵糖类并产酸，且其代谢产物中包含多种致龋相关的致病因子，成了目前已经明确的龋病致病菌[2-4]。利用传统的抑菌药物抑制变异链球菌往往会破坏口腔微生态，很难达到理想的效果[5]。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是在人体内广泛存在的非致病菌，其代谢产物中包含多种抑菌物质，能够广谱地抑制病原菌，并在人体内多个部位维持微生态的平衡[6-8]。已有研究从口腔中分离培养得到了枯草芽孢杆菌，并表明几种口腔致病菌的生长受到了枯草芽孢杆菌的抑制[9]。揭示变异链球菌的生长受枯草芽孢杆菌抑制的机制对于龋病的治疗及预防有着非常重要的意义。

利用代谢组学技术可对相对分子质量较低的微生物代谢产物进行全面的分析，且可反映微生物在此过程中真实的生理动态[10-11]，是揭示枯草芽孢杆菌对变异链球菌生长抑制机制的有力工具。因此，本研究采用基于1H核磁共振波谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)的代谢组学方法对变异链球菌菌液及与枯草芽孢杆菌代谢产物提取液共培养的变异链球菌菌液的代谢产物进行比较分析，以期初步揭示枯草芽孢杆菌抑制变异链球菌生长的机制，为探求安全、有效的龋病防治药物提供新的线索。

1 材料和方法

1.1 菌株及培养方法 变异链球菌S.mutans ATCC25157和枯草芽孢杆菌B. subtilis CMCC63501由西北民族大学甘肃省口腔疾病研究重点实验室提供。变异链球菌在牛脑心浸液(Brain heart infusion broth，BHI)培养基，37℃厌氧条件培养。枯草芽孢杆菌采用枯草芽孢杆菌选择性培养基T2培养基，37℃进行培养[12]。

1.2 枯草芽孢杆菌代谢产物的提取 取生长24h的枯草芽孢杆菌菌液，在4℃下3 000r/min离心5 min，吸取上清并用22μm滤器过滤。

1.3 生长曲线的建立 将BHI培养基中复苏培养12h的菌体离心收集，之后用PBS磷酸缓冲液重悬并调OD570至0.08。准备24管BHI培养基和24管加入枯草芽孢杆菌代谢产物的BHI培养基，每管10ml。分别将0.05ml重悬后的菌液加入每管培养基，每小时取1管测定OD值构建生长曲线。

1.4 胞外代谢产物的收集及处理 分别收集培养24h处于稳定期的变异链球菌及与枯草芽孢杆菌代谢产物共培养的菌液，在4℃、15 000r/min离心10min，将上清液提取后加入PBS磷酸缓冲液(1∶2)并静置5min。再4℃、15 000r/min离心10min，取上清0.5ml并与0.25ml重水混匀后置于核磁管内，保存于-80℃冰箱，测定前取出并保持在0℃左右，使用DRX600超导傅里叶变换NMR仪进行测定。

1.51H NMR的数据采集及分析 在配备了5mm PATXI探针，600.13 MHz质子频率的Bruker Avance Ⅱ 600波谱仪(Bruker公司，德国)上记录细胞外代谢物的1H NMR(300K)。随后在样点数64 000，谱宽9 001.95Hz下采用两个脉冲序列获得光谱[13]。对1H NMR的失真基线和相位进行手动校准。利用MestReC-v4.8软件将获得的原始自由感应衰减信号(Free induction decay，FID)数据进行傅里叶转换(Fourier transition，FT)获得1H-NMR图谱，并对1H-NMR谱进行分段积分得到积分值，将积分数据归一化[14]，随后通过Canoco 5.0软件进行主成分分析(Principal components analysis，PCA)。

2 结果

2.1 变异链球菌受枯草芽孢杆菌代谢物影响下的生长曲线 单独培养的变异链球菌以及与枯草芽孢杆菌代谢产物共同培养的变异链球菌初始浓度相同，在进入对数期后变异链球菌生长受到明显抑制，在培养12h后进入稳定期(图1)。

图1 变异链球菌受枯草芽孢杆菌代谢物影响下的生长曲线

2.2 胞外代谢产物分析1H NMR分析结果显示化学位移在δ0×10-6～10×10-6范围内存在大量胞外代谢产物，这些代谢产物主要包括亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等(图2)。

图2 胞外代谢产物的1H NMR分析

2.3 胞外代谢产物的主成分分析(PCA) 将胞外代谢产物1H NMR分析结果的积分数据进行PCA分析，从分析结果可以看出变异链球菌单独培养与共培养样点在PCA图上分为了两簇(图3)，这表明与枯草芽孢杆菌代谢产物共培养后，变异链球菌的代谢产物发生了改变，这些存在差异的代谢产物可能包含了亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等。

图3 胞外代谢产物的主成分分析

黑色圆点：变异链球菌 红色圆点：变异链球菌+枯草芽孢杆菌

3 讨论

本研究提取了枯草芽孢杆菌代谢产物，并将其与变异链球菌共培养，从测得的细菌生长曲线可以看出与单独培养的变异链球菌相比，共培养的变异链球菌生长受到了抑制(图1)，这表明枯草芽孢杆菌可以产生抑制变异链球菌生长的代谢产物。枯草芽孢杆菌的抑菌作用已经在很多领域被广泛应用[15]，寻找并利用能够抑制变异链球菌生长的代谢产物对龋病的防治具有重要意义。

为了揭示枯草芽孢杆菌抑制变异链球菌生长可能存在的机制，笔者从代谢组学的角度分析了变异链球菌单独培养及共培养的代谢产物。1H NMR结果的主成分分析表明了其两者之间存在差异(图3)，而这些表达存在差异的重要代谢产物可能是亮氨酸、乳酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等(图2)。变异链球菌致龋的关键毒力因子包含了胞外多糖合成、产酸、耐酸、黏附及形成生物膜等[2]。乳酸是致龋的关键因素，牙表面乳酸的形成可降低pH并导致龋齿的形成[16]。而亮氨酸、谷氨酸、苯乳酸、甘氨酸等均为三羧酸循环的重要中间产物，它们与细菌的生长与繁殖密切相关[17]。通过本研究的结果笔者认为枯草芽孢杆菌可能通过产生能够影响变异链球菌糖代谢和氨基酸代谢的产物，从而抑制了变异链球菌的生长。一方面，变异链球菌的生长及增殖受到了抑制，使其作为龋病的重要致病菌从数量上得以减少。另一方面，变异链球菌的糖酵解途径受到影响，使其产生的毒力因子作用降低。

本研究利用1H NMR代谢组学分析为揭示枯草芽孢杆菌抑制变异链球菌生长可能存在的机制提供了理论依据，然而要明确发生改变的代谢产物并对其进行定量还需要进行精确的靶向代谢组学分析。未来的研究还需结合多组学对该机制进行完整的揭示，以期为龋病的治疗提供安全、有效的药物，以及提出新的研究思路。