两种分枝杆菌鉴定及耐药检测方法在肺泡灌洗液中的应用价值*

赵佳慧，徐费凡，马 娟，施军卫

江苏省南通市第六人民医院：1.检验科；2.结核科，江苏南通 226011

尽管临床医师对结核病的诊断和治疗逐渐取得进展，但是耐药结核病仍然是危害公共卫生和生命安全的重大疾病之一[1]。2018年的世界卫生组织(WHO)全球结核病报告显示：2017年全球新发结核病例数约为1 000万，死亡病例约为160万。有研究报道，我国约有55.8万例利福平耐药结核病患者[2]。我国是耐药结核病的重灾区，耐药结核病患者人数位居全球第2位[3]。因此，耐药结核病的预防和治疗工作仍然是我国公共卫生事业的重点和难点。

在实验室检测方面，结核病的诊断和利福平耐药检测多依赖于传统结核分枝杆菌(MTB)培养和药敏试验，但所需时间较长，不利于患者早期、精准定位治疗[4-5]。近年来，随着分子生物学诊断方法的迅速发展，荧光聚合酶链反应(PCR)溶解曲线法和Gene Xpert MTB/RIF法显现出比较明显的早期诊断优势[6-8]，而其在支气管肺泡灌洗液中的诊断价值鲜见报道。因此，本研究将这两种分子生物学方法在支气管肺泡灌洗液中的应用价值进行比较，以期为耐药结核病的临床诊断和治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取2018年10月至2019年8月本院收治的门诊和住院患者支气管肺泡灌洗液标本共102例，灌洗液标本由结核科和呼吸科医生取自患者病变的肺部及远端支气管，经注入生理盐水并通过负压吸收，收集于无菌收集管中，每管10～15 mL。所有灌洗液标本均立即采用荧光PCR溶解曲线法和Gene Xpert MTB/RIF法进行检测和利福平耐药快速鉴定。在收集到的102例灌洗液中，经分枝杆菌病原学检测(涂片或者培养)，检测结果为阳性(结核性灌洗液)的患者59例，结果为阴性的(非结核性灌洗液)患者43例。两种类型灌洗液患者中男性患者分别为34、23例(P<0.05)，年龄分别为(59.44±14.23)、(56.27±7.53)岁(P>0.05)，有肺部空洞者分别为12、0例(P<0.05)，T-SPOT阳性患者分别为48、4例(P<0.05)。非结核性灌洗液43例患者中包括支气管扩张症8例，肺部结节18例，肺癌5例，肺炎10例以及其他疾病2例。

1.2仪器与试剂 荧光定量PCR仪(Lightcycler 480 PCR仪)购自美国Roche公司；Gene Xpert MTB/RIF设备及配套试剂购自美国Cepheid公司；MTB核酸提取试剂、MTB利福平耐药突变检测试剂盒及MTB复合体快速检测试剂盒均购自厦门致善生物科技有限公司；核酸提取仪购自海门其林贝尔制造有限公司。

1.3方法

1.3.1荧光PCR溶解曲线法与结果判读 取混匀后的灌洗液标本1 mL加入两倍体积的配制好的消化液消化5 min，取1 mL消化后的灌洗液标本转移至新标记好的EP管中，离心去除上清液后加入MTB DNA提取液(250 μL)，混匀后置于99 ℃恒温加热仪中加热20 min。再次离心，取5 μL离心后的上清液作为反应模板加入20 μL PCR反应液中。采用Lightcycler480 PCR仪进行目的片段扩增和溶解曲线分析。荧光PCR反应条件参照文献[9]。结果判断：(1)分枝杆菌检测，MTB复合群Tm值在FAM通道上为(61.4±1.5)℃。(2)利福平突变结果，①野生型，样品Tm值与内置阳性对照Tm值相同；②突变型，样品Tm值低于内置阳性对照Tm值2 ℃及以上。

1.3.2Gene Xpert MTB/RIF法与结果判读 取混匀后的灌洗液标本1 mL，加入两倍体积的商品化稀释液震荡30 s，静置15 min，取约2 mL消化好的标本于配套的Cartridge盒内，盖上盖子，于Gene Xpert系统程序中设置好位置和编号，反应过程约为2 h。结果判读：根据循环次数(CT)，系统自动识别为阴性、极低、低、中、高。CT<16判定为MTB检出“高”；CT 为16～22判定为MTB检出“中”，CT为>22～28判定为MTB检出“低”；CT为>28～38判定为MTB检出“极低”；CT>38判定为MTB未检出(阴性)。Probe A、B、C、D和E 5个探针是检测利福平rpoB基因是否发生突变的不同耐药位点，系统报告为阴性或耐药。

2 结 果

2.1两种分子生物学方法对分枝杆菌的鉴定结果 在分枝杆菌鉴定中，102例灌洗液中有57例经荧光PCR溶解曲线法鉴定为MTB复合群，有2例鉴定为非MTB，根据Tm值区间以及测序结果对比，证实这两例非MTB为龟脓肿分枝杆菌和牛分枝杆菌。该方法检测的阳性率为57.84%。在102例灌洗液标本中，有57例经Gene Xpert MTB/RIF法鉴定为MTB，阳性率为55.88%。其中有5例CT<16，MTB检出“高”；2例CT为16～22，MTB检出“中”；32例CT为>22～28，MTB检出“低”；18例CT为>28～38，MTB检出“极低”；其余45例CT>38，MTB未检出。两种方法的符合率为98.08%。

2.2两种分子生物学方法对利福平耐药突变的鉴定结果 荧光PCR溶解曲线法在57例MTB中检出15例利福平耐药突变，检出率为26.32%。Gene Xpert MTB/RIF法检出13例利福平耐药，检出率为22.81%。在检出的13例利福平耐药MTB中，针对利福平耐药的Probe E(529～533)区域检出耐药菌株5例，Probe B(512～518)区域检出耐药菌株3例，Probe D(523～529)区域检出耐药菌株3例，Probe A(507～511)区域检出耐药菌株2例。两种方法的符合率为96.61%。

2.3两种分子生物学方法与培养法对比 在收集的102例灌洗液中，荧光PCR溶解曲线法检出了59例分枝杆菌阳性标本及15例利福平耐药突变标本。Gene Xpert MTB/RIF法检出57例阳性标本和13例利福平耐药突变标本，两种方法的符合率之间差异无统计学意义(P>0.05)。以最终的培养结果为金标准，荧光PCR溶解曲线法诊断分枝杆菌的灵敏度为100.00%，特异度为100.00%，阳性预测值为100.00%，阴性预测值为100.00%。Gene Xpert MTB/RIF法诊断分枝杆菌的灵敏度为96.61%，特异度为100.00%，阳性预测值为100.00%，阴性预测值为95.56%。见表1～2。

表1 荧光PCR溶解曲线法和培养法结果对比(n)

表2 Gene Xpert MTB/RIF法和培养法结果对比(n)

3 讨 论

由于潜伏感染及耐药结核病患者数量的增加，结核病的发病率和患病率有所升高[10]。尽管结核病的病原学诊断方法很多，但大部分诊断方法依赖于结核病患者的依从性[11]。因此，病原学标本的质量对于临床早期诊断和治疗有着至关重要的作用。支气管肺泡灌洗液主要由临床医生在患者肺部病变部位和远端支气管反复灌洗所得，临床诊断的阳性率明显高于一般的检验标本，如痰液、胸腔积液等[12]。近年来，随着分子生物学方法的不断发展，用于MTB诊断及耐药突变鉴定的诊断试剂不断涌现[13-14]。其中，荧光PCR溶解曲线法和Gene Xpert MTB/RIF法由于操作比较简便，缩短了病原学诊断时间而被广泛应用[15-16]。利福平是目前临床使用的一线抗结核药物之一，其耐药现象最为普遍[17]。研究表明，90%的利福平耐药患者同时对异烟肼耐药[18-19]。因此，利福平是目前研究耐药结核病的主要检测药物。

荧光PCR溶解曲线法是一种基于Tm值变化而识别物种基因分型及耐药基因突变的较为简便的分子生物学检测技术[20]。该方法在一些疾病的早期分子诊断中广泛应用[21-23]。邹远妩等[24]将罗氏药敏法与荧光PCR溶解曲线法用于异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、莫西沙星和左氧氟沙星的耐药检测中，发现荧光PCR溶解曲线法对这几种药物的检测结果较为一致，且操作简便，检测速度快，是一种比较稳定的分子生物学检测方法[24]。也有科研人员将不同的临床标本(包括痰液、胸腔积液、腹水、脑脊液、灌洗液、脓液)用于利福平和异烟肼耐药检测，结果也发现该方法有较高的检测效能[25]。笔者之前的研究也发现，荧光PCR溶解曲线法在利福平和异烟肼耐药突变检测方面较传统的比例药敏法有更高的检测价值[9]。在之前的研究中，荧光PCR溶解曲线法主要用于培养阳性的MTB菌株的耐药基因检测，在此次研究中，笔者直接将支气管肺泡灌洗液用于核酸提取，并联合耐药诊断试剂盒直接检出分枝杆菌及其是否为利福平耐药，极大缩短了以往MTB的培养时间，为结核病患者的早期诊断和治疗提供了较好的实验室诊断基础。

Gene Xpert MTB/RIF法是一种全新的集分枝杆菌检测和利福平耐药检测于一体的全自动半定量实时PCR系统，其针对MTB 81 bp左右的利福平耐药核心区域设计引物，操作简便，可以全自动提取核酸并纯化，自动完成PCR反应并在2 h内出具检测结果[26]。研究发现，与直接涂片法和液体培养法比较，Gene Xpert MTB/RIF法有较好的一致性，并在结核性胸膜炎和脑膜炎的辅助诊断方面有较高的价值[27-28]。但这两种方法在支气管肺泡灌洗液中的应用鲜见报道。本研究结果发现，在102例灌洗液标本中荧光PCR溶解曲线法检出MTB 57例，另外检出非MTB 2例，其检出分枝杆菌的灵敏度为100.00%，特异度为100.00%，检出利福平耐药15例，检出率为26.32%。Gene Xpert MTB/RIF法检出MTB 57例，其检出分枝杆菌的灵敏度为96.61%，特异度为100.00%，检出利福平耐药13例，检出率为22.81%，两种方法的符合率为96.61%。与荧光PCR溶解曲线法比较，Gene Xpert MTB/RIF法耗时更短，操作方法更为简便，但荧光PCR溶解曲线法在分枝杆菌鉴定，尤其是在区分MTB复合群和非MTB方面更有优势。

综上所述，荧光PCR溶解曲线法和Gene Xpert MTB/RIF法在分枝杆菌检测和利福平耐药突变检测方面均有较高的灵敏度和特异度，两种方法也有较高的符合率。荧光PCR溶解曲线法在非MTB鉴定与分型上有较大优势，而Gene Xpert MTB/RIF法操作更为快速、简便。临床医师可根据病原学诊断的具体要求选择合适的实验方法，为临床诊断和早期治疗提供较好的实验室支撑。