miR-20a对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及与血清肿瘤标志物联合检测的诊断效能

杨文玲，陈宗涛

陆军军医大学第一附属医院健康管理科,重庆 400038

非小细胞肺癌(NSCLC)是临床上常见的恶性肿瘤，其发病率较高，约占肺癌总发病率的84%[1]。NSCLC的疗效及预后与诊断有着密切关系，由于NSCLC早期并无明显的临床症状，临床诊断过程中常出现漏诊或者误诊的情况，从而延误最佳治疗时机[2-3]。近年来，肿瘤标志物在临床应用中受到越来越多的关注，有研究表明，肿瘤标志物联合检测可提高NSCLC的诊断效能，但是这些标志物并非是NSCLC的特异性标志物，所以其在NSCLC诊断中的应用仍需不断探讨、考证[4]。本研究旨在探讨血清肿瘤标志物和miR-20a联合检测在NSCLC诊断中的价值，以期为NSCLC的临床早期诊疗提供可靠的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2013年1月至2015年1月收治的肺部疾病患者共206例，其中NSCLC患者[NSCLC组,在进行手术切除时保留癌组织和癌旁组织(距癌组织>5 cm)标本]112例，肺部良性疾病患者(良性肺病组)94例。NSCLC组中男58例，女54例；年龄45～76岁，平均(56.82±13.21)岁；肿瘤直径为1.6～5.9 cm，平均(3.45±1.25)cm。良性肺病组中男48例，女46例；年龄44～75岁，平均(54.72±12.11)岁。所有患者均经本院病理科明确诊断。排除标准：(1)心、肝、肾功能严重受损者；(2)近期接受过相关治疗者；(3)长期使用免疫抑制剂及糖皮质激素治疗者；(4)精神疾病患者；(5)其他癌症患者。受试者均签署知情同意书，本研究获得本院伦理委员会审核通过。

1．2方法

1.2.1标本采集 抽取10 mL空腹静脉血于非抗凝管中，然后4 000 r/min离心10 min分离血清，储存于-80 ℃冰箱，用于癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)等肿瘤标志物的检测。抽取10 mL空腹静脉血于抗凝管中，然后4 000 r/min离心10 min分离血浆，储存于-80 ℃冰箱，用于miR-20a检测。

1.2.2血清肿瘤标志物及miR-20a水平检测 采用电化学发光法(Roche Elecsys 2010)检测血清CEA、NSE、糖类抗原(CA)125水平。采用TaqMan试剂盒(赛默飞世尔；ID:000580;序列:UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG)在实时荧光定量PCR仪上检测miR-20a的表达水平。

1.2.3细胞培养、分组及转染 将细胞加入DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2的条件下培养于培养箱中，48 h后消化传代。采用LipofectamineTM2000试剂将miR-20a类似物(mimic-miR-20a)转染至A549细胞(该细胞来源于NSCLC细胞系)中，即mimic-miR-20a组，以仅加入LipofectamineTM2000试剂而未转染miRNA模拟物/抑制剂(mimics/inhibitor)的细胞为对照，即mimic-NC组。等量接种A549细胞于6孔板中，过夜培养A549细胞贴壁生长至80%～90%的融合度，mimic-miR-20a组用mimics(终水平为50 nmol/L)转染的完全培养基培养约24 h。

1.2.4细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力检测 (1)CCK8细胞增殖检测：将密度为105个/毫升的细胞悬液接种于96孔板中，每孔接种200 μL。培养48 h后加入10 μL的CCK8试剂，孵育2 h后用酶标仪检测450 nm处的吸光度，检测细胞的增殖情况。(2)Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测：将收集到的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次后用400 μL的结合缓冲液(binding buffer)重悬，然后分别加入10 μL的Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)，避光孵育20 min，采用流式细胞术检测细胞的凋亡水平。(3)细胞划痕实验：按照2×106个/孔的密度将细胞接种于6孔板中，培养48 h后用20 μL的枪头在6孔板上划出划痕，在0 h和24 h这两个时间点进行拍照，量取细胞的迁移距离。(4)碳酸脂膜(Transwell)侵袭实验：用基质胶(matrigel)包被Transwell上层小室，加入200 μL DMEM重悬的密度为105个/毫升的细胞悬液，下层用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM填满，培养48 h后将侵袭的细胞固定，用结晶紫染色，对侵袭细胞进行计数。

1.3判断标准 以病理检查结果为金标准。联合检测时，CEA、NSE、CA125和miR-20a任意一项水平超过其临界值判定为阳性；全部指标水平低于其临界值判定为阴性。

2 结 果

2.1miR-20a在NSCLC组织中的表达水平及与患者生存率的相关性 与癌旁组织相比，miR-20a在NSCLC组织中的表达水平明显升高(P<0.05)。经过5年的随访，47例患者因肺癌死亡。采用Kaplan-Meier曲线分析miR-20a表达水平与患者生存率之间的相关性，结果表明，miR-20a的表达水平与患者的生存率呈负相关(P<0.05)。见图1～2。

2.2miR-20a对A594细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的调控作用 在A594细胞中过表达miR-20a，实时荧光定量PCR结果表明，miR-20a在A594细胞中有着较高的过表达效率(图3A)。CCK8细胞增殖检测结果表明，过表达miR-20a可明显促进A594细胞的增殖(图3B)，且流式细胞术结果证明过表达miR-20a后，A594细胞的凋亡水平明显降低(图3C)。此外，细胞划痕实验和Transwell 侵袭实验结果表明，在A594细胞中过表达miR-20a可明显促进细胞的迁移与侵袭(图3D～E)。

2.3两组血清肿瘤标志物及miR-20a表达水平比较 NSCLC组患者血清CEA、CA125以及NSE的表达水平明显高于良性肺病组(P<0.05)；另外，NSCLC组患者血浆miR-20a的表达水平明显高于良性肺病组(P<0.05)。见表1。

注：与癌旁组织比较，*P<0.05。

图2 miR-20a的表达水平与NSCLC患者生存率的相关性

2.4血清肿瘤标志物以及miR-20a在各组的检出情况比较 NSCLC组患者CEA、NSE、CA125以及miR-20a的阳性检出率明显高于良性肺病组；联合检测结果为阳性(上述指标任意一项水平超过其临界值)的患者在NSCLC组中所占的比例明显高于良性肺病组。见表2。

注：A为miR-20a在A594细胞中的过表达效率；B为miR-20a对A594细胞增殖能力的调控作用；C为miR-20a对A594细胞凋亡水平的调控作用；D为miR-20a对A594细胞迁移能力的调控作用，以0 h作为参照；E为miR-20a对细胞侵袭能力的调控作用；*P<0.05。

图3 miR-20a对A594细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的调控作用表1 两组血清肿瘤标志物及miR-20a的表达水平比较

表2 两组血清肿瘤标志物及miR-20a检出情况比较(n)

2.5血清肿瘤标志物与miR-20a联合检测在NSCLC诊断中的价值 NSE诊断NSCLC的灵敏度为61.28%，特异度为84.66%，明显高于其他血清肿瘤标志物；miR-20a对NSCLC也有较高的灵敏度与特异度。CEA、NSE、CA125、miR-20a联合检测对NSCLC的诊断效能远高于各肿瘤标志物单独检测，其灵敏度达73.21%，特异度达91.49%，见表3。

表3 各指标单独及联合检测的诊断效能(%)

3 讨 论

miRNA是一类不能编码蛋白质、长度小于25个核苷酸的小RNA，研究表明，miRNA的异常表达与癌症的发生、发展有着紧密的联系[5]。本研究表明，miR-20a高表达于NSCLC组织中，且过表达的miR-20a可显著促进A594细胞的增殖、侵袭与迁移。许荣誉等[6]研究表明，miR-20a在NSCLC组患者血浆中的表达水平及阳性检出率明显高于良性肺病组患者，且miR-20a的表达水平与肿瘤的分化程度、临床分期以及淋巴结转移有着密切关系，与本研究结果基本一致。

鉴于miR-20a在NSCLC组织中的生物作用，笔者认为miR-20a还可以在NSCLC的诊断试验中起作用。本研究发现，miR-20a在NSCLC组患者血浆中的表达水平明显高于良性肺病组患者，并且其灵敏度为58.04%，特异度为80.85%。因此，笔者认为miR-20a可以作为NSCLC诊断试验中的一个生物标志物。

此外，本研究还探讨了CEA、NSE和CA125在NSCLC诊断中的价值，结果显示，CEA高表达于NSCLC患者血清，NSCLC患者CEA阳性检出率明显高于肺部良性疾病患者，但是其对NSCLC的特异度和灵敏度较低。CEA是一种由胃肠道分泌的糖蛋白，具有胚胎抗原特异性。早期的研究表明，血清中CEA的高表达与大肠癌的发病息息相关，因此可作为大肠癌的特异性标志物应用于临床诊断[7-8]。随着研究的深入，CEA在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌等恶性肿瘤中的异常表达逐渐被发现，因此CEA被当作肿瘤诊断标志物广泛应用于临床，并且许多研究报道指出，其在NSCLC的诊断中有重要意义[9-10]。

本研究中NSCLC患者血清NSE水平以及阳性检出率均明显高于肺部良性疾病患者，并且其特异度和灵敏度较高，分别为84.56%、61.28%。NSE特异性地存在于中枢及周围神经系统，由于NSCLC属于神经内分泌类肿瘤，因此NSE对NSCLC的诊断具有较高的特异度与灵敏度[11]。

相较于肺部良性疾病患者，NSCLC患者血清CA125水平和阳性检出率明显升高，且CA125诊断NSCLC的灵敏度达51.79%，特异度达75.26%。CA125是一种储存于细胞内的糖蛋白，正常情况下由于细胞间连接和基底膜的阻挡,CA125无法进入血液循环，因此健康人血液中CA125水平极低。当组织出现癌性病变时，细胞之间的连接及基底膜遭到破坏，血液中的CA125水平会明显升高[12-14]。随着研究的深入，不少报道指出，其在肺癌患者血清中的阳性检出率偏高，且其诊断肺癌的灵敏度为30%～60%，特异度为34%～67%[15]，这与本研究结果基本一致。

综上所述，CEA、NSE、CA125及miR-20a作为NSCLC的诊断标志物各有优点，但是单独使用时的特异度和灵敏度并不理想。本研究将3种血清肿瘤标志物与血浆miR-20a联用，发现联合检测对于诊断NSCLC的灵敏度和特异度均高于各指标单独检测，这提示miR-20a、CEA、NSE及CA125联合检测可能更具有诊断价值。