GeneXpert MTB/RIF检测系统在结核病诊断中的应用价值*

陈小娟，赵珍珍，向 尹，应斌武△

1.四川大学华西医院实验医学科,四川成都 610041；2.乐山市人民医院医学检验科,四川乐山 614000

结核病是一种由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染病，严重危害人类健康，是全球十大死亡原因之一，也是引起死亡人数最多的单一传染性疾病[1]。早期诊断、及时抗结核治疗对患者预后及预防MTB的传播至关重要。传统的实验室检测方法如涂片抗酸染色查找MTB、MTB培养等均存在各自的缺点。有研究报道，涂片抗酸染色显微镜检查只能检出每毫升>10 000个抗酸杆菌的标本[2]，灵敏度低；而作为金标准的MTB培养法耗时长,不能满足临床对结核病早期诊断和治疗的需求。因此,临床迫切需要快速、敏感、特异的MTB感染诊断方法。GeneXpert MTB/RIF检测系统(简称GeneXpert MTB/RIF)利用巢式实时荧光定量PCR方法，通过检测MTB编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因的81 bp利福平耐药核心区间(RRDR)是否突变,进而辅助诊断MTB感染及利福平耐药,能在2 h内完成检测[3]。GeneXpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度高,其检出限为131 CFU/mL,远低于抗酸染色[4]。2010年世界卫生组织(WHO)推荐GeneXpert MTB/RIF用于肺结核的诊断[5],并在2013年推荐其用于肺外结核的诊断[6]。然而,GeneXpert MTB/RIF在结核病诊断中的应用价值在不同地区之间报道存在差异[7]。本文旨在评价我国西南地区GeneXpert MTB/RIF在结核病临床诊断中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 连续收集2020年7—9月四川大学华西医院收治的临床高度疑似结核病的住院患者，排除人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性及临床资料不全者，最终纳入401例患者为研究对象。根据结核病复合诊断标准(CRS)，分为结核组(186例)和非结核组(215例)。所有研究对象中男242例,女159例,平均年龄(50.15±17.63)岁。MTB检测标本来自患者的痰液117例，肺泡灌洗液173例，胸腔积液及腹水52例，脑脊液16例，赘生物(组织)13例，穿刺液19例，尿液11例，均进行抗酸染色、结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(TB-DNA)荧光定量PCR及GeneXpert MTB/RIF 3项检测。同时对所有患者抽取静脉血行结核感染T细胞γ-干扰素释放试验(TB-IGRA)。以临床最终诊断结果为金标准对4种检测方法的检出率、灵敏度、特异度等指标进行统计分析，评价GeneXpert MTB/RIF对结核病的诊断效能。本研究由四川大学华西医院伦理委员会审核通过[审批号：2019年审(829)号]，所有研究对象均签署知情同意书。结核组纳入标准：根据我国肺结核诊断标准(WS288-2017)和结核病分类标准(WS196-2017)，具有典型的结核病临床症状，且至少符合以下几项之一：(1)MTB病原学检测阳性；(2)病理学诊断支持结核病变；(3)影像学检查有活动性结核病的证据；(4)两次以上TB-IGRA阳性且抗结核治疗有效。

1.2仪器与试剂 本研究使用美国Cepheid公司的GeneXpert MTB/RIF及配套试剂，德国凯杰(QIAGEN)公司的TB-DNA试剂盒，实时荧光定量PCR仪型号为ABI QuantStudio5，MTB抗酸染色使用珠海贝索生物有限公司生产的染液。

1.3方法

1.3.1MTB涂片抗酸染色 按照标准操作规范及试剂说明书进行涂片抗酸染色后于显微镜(油镜)下观察计数,每100个视野可见抗酸杆菌3条及以上为阳性。

1.3.2TB-DNA荧光定量PCR 严格按照说明书进行标本前处理及核酸提取后,PCR反应混合液按照每测试37.8 μL PCR反应液，0.2 μL Taq酶和0.06 μL尿嘧啶糖基化酶的比例配制，从中取38.0 μL与2.0 μL已提取的标本DNA混合，构建PCR反应体系。在实时荧光定量PCR仪中扩增，扩增程序如下：37 ℃ 3 min，93 ℃ 1 min，93 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s(40个循环)。反应体系为40.0 μL。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF 检测 在生物安全柜内按照标准操作规范操作,在前处理管中视标本性状将标本与标配的处理液按1∶2的比例混合(若标本较浓稠则按≥1∶3的比例混合;脑脊液或相对清亮的浆膜腔积液可不处理直接检测),漩涡震荡后静置15 min，标本充分液化后取2.0～2.5 mL加入GeneXpert检测匣，于GeneXpert MTB/RIF进行检测,检测时间约2 h。

1.3.4TB-IGRA检测 按照结核感染T细胞检测试剂盒(体外释放酶联免疫法)说明书,采集患者4 mL肝素抗凝血,在2 h内将患者全血标本轻柔颠倒混匀5次后取1 mL分装到本底对照培养管(N)、测试培养管(T)、阳性对照培养管(P)培养基，迅速放入37 ℃培养箱培养(22±2)h后，将培养管于3 000～5 000 r/min离心机中离心10 min,取血浆进行ELISA检测,计算γ-干扰素(IFN-γ)水平。结果判定:T-N≥14 pg/mL为阳性,<14 pg/mL为阴性。如果校准品400 pg/mL的平均A值<1.0或试验结果出现剂量-反应曲线相关系数r<0.990 0,则试验无效，需重复试验。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行统计分析。计数资料采用例数或百分率表示，各方法检出率的比较采用χ2检验，以检出率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值描述各检测方法的诊断效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1MTB在不同类型标本的检出情况 在结核组，GeneXpert MTB/RIF检测各类标本情况如下：痰液检出率为51.85%；肺泡灌洗液检出率为43.59%；胸腔积液及腹水检出率为11.11%；脑脊液检出率为22.22%；赘生物(组织)检出率为50.00%；穿刺液检出率为42.86%；尿液检出率40.00%。见表1。

2.2各检测方法的诊断效能评估 本研究纳入的401例疑似结核病患者，临床最终诊断结果为结核病186例，非结核病215例。各方法检测结核组和非结核组的结果见表2。在MTB的检测技术中,GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA荧光定量PCR的检出率分别为19.45%、6.73%、18.45%，其中3例TB-DNA荧光定量PCR阳性患者临床最终诊断为非结核病，1例抗酸染色阳性患者最终诊断为非MTB感染。在患者全血标本TB-IGRA检测中,检出阳性235例，检出率为58.60%(235/401)。以临床最终诊断结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA荧光定量PCR、TB-IGRA 4种方法诊断结核病的灵敏度分别为41.94%、13.98%、38.17%、69.35%，特异度分别为100.00%、99.53%、98.60%、50.70%，阳性预测值分别为100.00%、96.30%、95.95%、54.89%，阴性预测值分别为66.56%、57.22%、64.83%、65.66%。结果显示：在结核组，GeneXpert MTB/RIF检出阳性78例，灵敏度为41.94%，较抗酸染色(13.98%)明显提高，差异有统计学意义(χ2=36.090,P<0.05)，而与TB-DNA荧光定量PCR(38.17%)相比，差异无统计学意义(χ2=0.549,P=0.459)；TB-IGRA检出阳性129例，灵敏度为69.35%，较其他3种方法灵敏度明显提高(χ2=118.764,P<0.05),但其在非结核组检出阳性106例，阴性109例，特异度为50.70%，明显低于其他3种方法(χ2=342.791,P<0.001)。

表1 结核组和非结核组的各类型标本MTB检出情况[%(n/n)]

表2 GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA荧光定量PCR、TB-IGRA诊断结核的效能比较

续表2 GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA荧光定量PCR、TB-IGRA诊断结核的效能比较

2.3GeneXpert MTB/RIF对利福平耐药的检测 在78例GeneXpert MTB/RIF检测阳性的患者中，检出利福平耐药共7例，其中2例为痰液标本，2例为肺泡灌洗液标本，1例为胸腔积液标本，2例为穿刺液标本，临床据此结果对上述7例患者行表型药敏试验后均诊断为利福平耐药。

3 讨 论

GeneXpert MTB/RIF可同时进行MTB及利福平耐药检测，是集标本处理、PCR扩增于一体的全封闭自动化分子检测平台。近年来,基于其具有灵敏度高、特异度高、生物安全性高、检测速度快等优点，该技术被用于肺内及肺外结核标本中MTB及利福平耐药检测、临床分离的MTB菌株的检测等,并成为WHO推荐的MTB分子检测技术[8-9]。

本研究通过比较GeneXpert MTB/RIF与抗酸染色、TB-DNA荧光定量PCR、TB-IGRA检测的灵敏度和特异度等指标,初步探讨其在诊断结核感染方面的应用价值。本研究中,GeneXpert MTB/RIF、抗酸染色、TB-DNA荧光定量PCR、TB-IGRA的检测灵敏度分别为41.94%、13.98%、38.17%、69.35%,特异度分别为100.00%、99.53%、98.60%、50.70%。结果显示，在特异度方面GeneXpert MTB/RIF为100.00%，优于其他3种方法。抗酸染色特异度虽也较高，但其灵敏度较低，且检测阳性者需进一步行分枝杆菌菌种鉴定，如本研究中1例抗酸染色阳性患者最终诊断为非MTB感染。灵敏度方面，GeneXpert MTB/RIF仅次于TB-IGRA，但TB-IGRA检测基于免疫学原理，结果依赖于患者的免疫状态，DRUSZCZYNSKA等[10]报道，既往感染MTB及长期暴露于MTB环境中均可导致TB-IGRA结果不完全可靠。本研究中TB-IGRA的特异度为50.70%，较文献[11]报道的65.80%更低，这可能与研究对象年龄、性别、免疫状态及病毒感染状态有关，需进一步扩大样本量进行研究。从检测平台的易用性来看，GeneXpert MTB/RIF检测快速、简便，对试验条件要求低且不易污染。本研究中TB-DNA荧光定量PCR在非结核组检出3例假阳性，可能是操作过程中的污染造成的(TB-DNA荧光定量PCR检测手工操作烦琐、对试验条件要求高且容易造成交叉污染)。此外，GeneXpert MTB/RIF在利福平耐药检测方面，虽然本次研究病例较少，检出耐药患者7例，但均与表型药敏试验结果相符，表明其具有较好的临床用药指导价值。

另外,通过比较GeneXpert MTB/RIF检测不同类型标本中的MTB检出率,分析不同类型标本对诊断结核的影响。本研究中,GeneXpert MTB/RIF在痰液中检出率最高(51.85%),其次是赘生物(组织)(50.00%),而其在胸腔积液及腹水中检出率最低(11.11%),这与ALLAHYARTORKAMAN等[12]的研究结果相符。本研究中GeneXpert MTB/RIF在脑脊液中灵敏度低于DENKINGER等[13]和GARG[14]的报道,可能与脑脊液含菌量较低有关。本研究显示,GeneXpert MTB/RIF检测与涂片抗酸染色镜检、TB-DNA荧光定量PCR检测相比,在几种肺外结核标本如脑脊液、胸腔积液及腹水、穿刺液中均具有更高的检出率,这也与多项同类研究结果相似[13,15]。因此,GeneXpert MTB/RIF在本研究的4种检测方法中,对肺结核和肺外结核均具有更高的诊断效能。但由于本研究病例较少,结果存在一定局限性,接下来应扩大样本量并将MTB培养及MTB表型药敏试验加入研究中。

综上所述，GeneXpert MTB/RIF在结核病诊断中具有较好的应用价值，有助于临床医生对结核病患者进行早期、快速的诊断。