lncRNA MIR4435-2HG通过靶向miR-873-5p调控小儿神经母细胞瘤细胞生物学功能①

倪文昌 金 泉 王丽艳 查运红

(武汉市第三医院儿科，武汉 430000)

神经母细胞瘤是儿童常见颅外实体瘤之一，占儿童癌症相关死亡人数的15%[1]。其临床表现广泛，部分良性肿瘤不经化疗可自行消退，其他转移性疾病甚至对高强度治疗耐药，即使接受强化治疗，最具侵袭性的神经母细胞瘤患者存活率仍低于40%[2]。神经母细胞瘤进展的机制仍有待进一步研究。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被定义为长度超过200个核苷酸的转录本，与包括神经母细胞瘤在内的癌症进展密切相关[3]。研究表明，lncRNA MIR4435-2HG可促进前列腺癌细胞迁移和侵袭[4]。上调MIR4435-2HG可提高胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及小鼠的致瘤性[5]。对DNA甲基化和基因表达谱的综合分析发现，MIR4435-2HG是导致胶质瘤进展的致癌lncRNA[6]。miR-873-5p可作为结直肠癌的肿瘤抑制因子抑制结直肠癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭，影响细胞周期，并促进其凋亡[7]。但MIR4435-2HG和miR-873-5p对神经母细胞瘤生物学功能的影响尚未阐明。研究显示，lncRNA有多个miRNA响应元件，如MIR4435-2HG靶向miRNA-487a促进肝癌细胞增殖[8，9]。本文探讨神经母细胞瘤中MIR4435-2HG和miR-873-5p的靶向调控作用，考察MIR4435-2HG在神经母细胞瘤组织及其相应组织正常脊髓背根神经节中的表达，及其对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并结合miR-873-5p阐明潜在的作用机制[10]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与主要试剂 神经母细胞瘤SK-N-SH细胞、人脐静脉内皮细胞HUVEC购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，MEM培养基、F12K培养基、Lipofectamine 2000购自美国invitrogen公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；RT-qPCR相关检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；si-MIR4435-2HG、pcDNA-MIR4435-2HG、miR-873-5p、anti-miR-873-5p、荧光素酶报告载体购自上海GenePharma公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司；细胞核相关抗原(nuclear associated antigen Ki67，Ki-67)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、活化的多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved poly ADP-ribose polymerase，Cleaved PARP)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥公司。

1.1.2组织标本来源 34例组织标本来源于武汉市第三医院2015年6月～2019年6月因神经母细胞瘤接受手术治疗的患者，新鲜标本取材后立即置于液氮中冻存用于qPCR检测。所有患者经病理学确诊为神经母细胞瘤，患者或家属知情同意。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 人脐静脉内皮细胞HUVEC加入含有10%胎牛血清的F12K培养基，SK-N-SH细胞加入含有10%胎牛血清的MEM培养基，于37℃、5%CO2孵育，每周换液2～3次，1∶3进行细胞传代。选取对数生长期SK-N-SH细胞，以适当密度接种于6孔板，待细胞生长至70%融合时，利用Lipofectamine 2000试剂将si-MIR4435-2HG、pcDNA-MIR4435-2HG、miR-873-5p、anti-miR-873-5p及其阴性对照转染至SK-N-SH细胞，转染48 h后收集细胞检测。

1.2.2qPCR检测lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p表达 按照说明书进行，采用TRIzol试剂提取组织或细胞总RNA，逆转录为cDNA，进行qPCR反应，引物序列：lncRNA MIR4435-2HG F：5′-TGATAAAGGGCTCTGAAAGC-3′，R：5′-CACGATGCCTTCACCAGTGT-3′；miR-873-5p F：5′-TGTGCATTTGCAGGAACTTGT-3′，R：5′-GGGAACTCATCAGTCT-CCTGTTC-3′；U6 F：5′-ACACCAAGCAGTCCGAAG-AG-3′，R：5′-ACAAAATTTCTCACGCCGGT-3′。2-ΔΔCt法计算lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p表达。

1.2.3MTT检测SK-N-SH细胞增殖 转染后的SK-N-SH细胞经胰酶消化后，1×104个/ml接种于96孔板，培养48 h后加入MTT溶液100 μl，培养4 h，加入DMSO 200 μl剧烈反应10 min，酶标仪测定490 nm处SK-N-SH细胞吸光度(OD)，计算细胞存活率(%)=(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100%。

1.2.4流式细胞术检测SK-N-SH细胞凋亡 离心后收集SK-N-SH细胞1×105个，根据Annexin V-FITC 凋亡试剂盒说明书操作，加入500 μl缓冲液重悬细胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混匀，室温避光反应15 min，流式细胞术测定细胞凋亡。

1.2.5Western blot检测Ki-67、CDK2、Cleaved Cas-pase-3、Cleaved PARP、MMP-2和MMP-9蛋白表达 采用RIPA裂解液提取SK-N-SH细胞总蛋白，吸取20 μg蛋白样品，10%SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Ki-67、CDK2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、MMP-2、MMP-9一抗，4℃孵育过夜，次日采用TBST充分漂洗，加入二抗孵育2 h，TBST充分漂洗，ECL显影，以β-actin为内参计算蛋白表达。

1.2.6Transwell检测SK-N-SH细胞迁移和侵袭 在SK-N-SH细胞迁移实验中，调整细胞密度为5×105个/ml，吸取100 μl接种于Transwell小室上室，下室加入500 μl含血清培养基，37℃孵育24 h，无菌棉签拭去多余细胞甲醛固定15 min，结晶紫染色15 min，显微镜下观察、计数。在SK-N-SH细胞侵袭实验中，将Matrigel胶与无血清培养基以1∶5 充分混合，吸取100 μl于小室上室，37℃静置3～4 h。其余操作同上。

1.2.7双荧光素酶报告实验检测lncRNA MIR4435-2HG与miR-873-5p靶向关系 采用starBase网站预测lncRNA MIR4435-2HG与miR-873-5p的靶向结合关系，发现二者含有互补核苷酸序列。分别建立含有miR-873-5p结合位点的MIR4435-2HG 3′UTR区野生型(WT-MIR4435-2HG)与突变型(MUT-MIR4435-2HG)报告基因的质粒，利用Lipofectamine 2000试剂将其与miR-873-5p、miR-con共转染，转染48 h后测定双荧光素酶活性。

2 结果

2.1lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在神经母细胞瘤组织和正常脊髓背根神经节中的表达 RT-qPCR结果显示，与正常脊髓背根神经节相比，神经母细胞瘤组织MIR4435-2HG表达显著升高，miR-873-5p表达显著降低(P<0.05，表1)；与HUVEC细胞相比，SK-N-SH细胞MIR4435-2HG表达显著升高，miR-873-5p表达显著降低(P<0.05，表2)。

表1 lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在神经母细胞瘤组织和正常脊髓背根神经节的表达Tab.1 Expressions of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p in neuroblastoma tissues and normal spinal dorsal root

表2 lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在HUVEC细胞和SK-N-SH细胞中的表达Tab.2 Expressions of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p in HUVEC and SK-N-SH

2.2沉默MIR4435-2HG抑制SK-N-SH细胞增殖，诱导其凋亡 MTT检测结果显示，与si-con组相比，沉默MIR4435-2HG明显降低SK-N-SH细胞存活率(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现，相比于si-con组，沉默MIR4435-2HG显著提高SK-N-SH细胞凋亡率(P<0.05)，Western blot检测结果表明，同si-con组相比，沉默MIR4435-2HG明显降低细胞Ki-67、CDK2蛋白表达，并提高Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白水平(P<0.05)。见图1、表3。

表3 沉默MIR4435-2HG对SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响Tab.3 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell proliferation and

图1 沉默MIR4435-2HG对SK-N-SH细胞增殖凋亡、凋亡相关蛋白表达的影响Fig.1 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell proliferation apoptosis and expressions of apoptosis-related proteins

2.3沉默MIR4435-2HG抑制SK-N-SH细胞迁移和侵袭 Transwell检测结果显示，与si-con组相比，沉默MIR4435-2HG显著降低SK-N-SH细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达，细胞迁移和侵袭数降低减少(P<0.05，表4、图2)。

图2 Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达Fig.2 Western blot detection of MMP-2 and MMP-9 proteins expressionsNote:1.NC；2.si-con;3.si-MIR4435-2HG.

表4 沉默MIR4435-2HG对SK-N-SH细胞迁移和侵袭的影响Tab.4 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell migration and

2.4MIR4435-2HG靶向调控miR-873-5p表达 star-Base预测发现，lncRNA MIR4435-2HG与miR-873-5p部分核苷酸序列可形成互补配对(图3)。双荧光素酶报告实验表明，与miR-con组相比，miR-873-5p明显降低WT-MIR4435-2HG荧光素酶相对活性(P<0.05)，而不影响MUT-MIR4435-2HG荧光素酶相对活性(表5)。与si-con组相比，si-MIR4435-2HG组miR-873-5p表达显著上升，pcDNA-MIR4435-2HG组比pcDNA组显著降低(P<0.05，表6)。

表5 双荧光素酶报告实验Tab.5

表6 lncRNA MIR4435-2HG对miR-873-5p表达的影响Tab.6 Effect of lncRNA MIR4435-2HG on miR-873-5p

图3 lncRNA MIR4435-2HG与miR-873-5p靶向关系预测Fig.3 Targeting relationship prediction of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p

2.5转染miR-873-5p抑制SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭并诱导其凋亡 与miR-con组相比，SK-N-SH细胞转染miR-873-5p可明显降低细胞存活率、迁移数、侵袭数和Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达，并显著提高细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达(P<0.05，表7、图4A)。

表7 转染miR-873-5p对SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Tab.7 Effect of transfection of miR-873-5p on SK-N-SH cell proliferation,migration,invasion and

2.6干扰miR-873-5p表达部分逆转沉默lncRNA MIR4435-2HG对SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 与si-MIR4435-2HG和anti-miR-con共转染组相比，si-MIR4435-2HG和anti-miR-873-5p共转染可明显提高SK-N-SH细胞存活率、迁移数、侵袭数、Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表达，显著降低细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达(P<0.05，表8、图4B、C)。

图4 Western blot检测SK-N-SH细胞Ki-67、CDK2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、MMP-2和MMP-9蛋白表达Fig.4 Western blot detection of Ki-67,CDK2,Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP,MMP-2 and MMP-9 proteins expressions in SK-N-SH cells

表8 干扰miR-873-5p和沉默lncRNA MIR4435-2HG对SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响Tab.8 Effects of interference with miR-873-5p and silencing lncRNA MIR4435-2HG on proliferation,migration,invasion and apoptosis of SK-N-SH

3 讨论

神经母细胞瘤是一种发生于交感神经系统的胚胎癌，是婴儿出生后1年内最常见恶性肿瘤。在15岁以下儿童中，神经母细胞瘤约占所有恶性肿瘤的8%。尽管多种治疗方法对神经母细胞瘤有效，但患者5年存活率仅为70%，尤其是高危神经母细胞瘤患者的治愈率仍低于40%[11]。且患者生活受到终身的严重影响，是家庭和公众健康的巨大负担和挑战，但神经母细胞瘤的发病机制尚未阐明。

最近报道指出，lncRNA在神经母细胞瘤的发病机制中发挥关键作用，如XIST、RMRP、MAGI2-AS3等[12-14]。本研究发现，MIR4435-2HG在神经母细胞瘤中表达上调，已有研究表明，MIR4435-2HG在前列腺癌、肝癌、胃癌等肿瘤组织中表达上调，已被证实为胃癌、肝癌等的致癌lncRNA，可促进癌症进展[5，9]。MIR4435-2HG在肺癌组织中高表达，并与组织学分级和淋巴结转移相关，其下调可抑制肺癌细胞增殖和体内外侵袭，高表达MIR4435-2HG可促进肺癌细胞增殖与侵袭[15]。本研究中，与正常脊髓背根神经节相比，神经母细胞瘤组织中MIR4435-2HG表达上调，MIR4435-2HG在神经母细胞瘤细胞中表达上调。提示MIR4435-2HG可能参与神经母细胞瘤的发生发展。沉默MIR4435-2HG可明显降低SK-N-SH细胞存活率、细胞迁移数、侵袭数、Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表达，显著提高细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白水平，说明沉默其表达可抑制神经母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，MIR4435-2HG在神经母细胞瘤中可能充当致癌基因，与既往研究结论一致[5,9,16]。

研究表明，miRNA失调影响包括神经母细胞瘤在内的人类癌症的生物学过程[16-19]。miR-873-5p是miRNA家族成员，已被证实在部分人类癌症中具有抑癌作用[20]。Li等[21]学者检测到结直肠癌细胞中miR-873-5p呈低表达，miR-873-5p过表达可抑制结直肠癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化。miR-873-5p是一种肿瘤抑制因子，可抑制结肠癌细胞增殖、集落形成和侵袭，阻止结肠癌细胞体内外转移[22]。胃癌组织中miR-873-5p表达下降，过表达miR-873-5p可降低胃癌细胞活力，导致细胞凋亡和细胞周期阻滞[23]。本实验RT-qPCR检测结果显示，神经母细胞瘤组织和细胞中miR-873-5p表达下调。SK-N-SH细胞中转染miR-873-5p可明显降低细胞存活率、迁移数、侵袭数和Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达，并显著提高细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达，与既往研究结论相同。miR-873-5p在神经母细胞瘤中同样为抑癌基因，抑制神经母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。为进一步探索MIR4435-2HG影响神经母细胞瘤生物学功能的分子机制，本研究采用生物学信息工具预测MIR4435-2HG与miR-873-5p存在靶向结合位点，推测MIR4435-2HG可能通过靶向调控miR-873-5p发挥作用。双荧光素酶报告和RT-qPCR实验证实miR-873-5p是MIR4435-2HG的功能性靶基因之一。另外，共转染si-MIR4435-2HG和anti-miR-873-5p发现，干扰miR-873-5p可部分逆转沉默MIR4435-2HG对SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。沉默MIR4435-2HG通过功能实验研究MIR4435-2HG对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学功能的影响，靶向调控miR-873-5p表达是研究MIR4435-2HG在神经母细胞瘤中发挥生物学功能的分子机制，后者在前者的基础上进一步探索，共同解释了MIR4435-2HG的功能和意义。说明MIR4435-2HG通过直接靶向miR-873-5p调控神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。

综上所述，MIR4435-2HG在神经母细胞瘤中表达上调，沉默MIR4435-2HG表达可抑制神经母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，其作用机制与靶向调控miR-873-5p表达密切相关，为神经母细胞瘤的临床诊治提供有价值的生物学标志物和靶点。