出生后大气细颗粒物吸入暴露对幼鼠部分免疫指标的影响及其作用机制①

刘超斌 李快乐 谢 熙 黄惠娟 王 萍 洪新如④

(福建省妇幼保健院，福建医科大学附属医院妇四科,福州 350001)

免疫性疾病是儿童常见病，以哮喘最为常见。近20年我国儿童哮喘的患病率持续升高，全国城市14岁以下儿童哮喘的累积患病率为1.09%，2010年上升为3.02%[1]。免疫性疾病是内部遗传因素与外部环境因素相互作用的结果。在诸多不良环境因素中，空气污染危害较为显著。在常规监测的空气污染物中，细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)因粒径小、成分复杂、毒性成分多，对健康危害最为显著[2]。我国是空气污染较为严重的国家，《中国环境状况公报》显示，2017年全国338个地级及以上城市中有239个城市空气污染超过GB3095-2012标准(Ⅰ、Ⅱ级标准年均值分别为15、35 μg/m3，日均值为35、75 μg/m3)，部分地区频发雾霾加重了污染程度；以PM2.5污染为主的天数占重度及以上污染天数的74.2%，因此，PM2.5为首要污染物[3]。尽管福州市的空气质量相对洁净，但其PM2.5浓度年均值也达到44～58 μg/m3，已超过GB3095-2012，是发达国家城市一般水平的2～4倍[4,5]。

鉴于大气污染无时不有、无处不在，其不良健康影响已成为世界范围内的公共健康问题，PM2.5对儿童哮喘的影响更是成为关注焦点[6]。研究表明，PM2.5暴露与儿童和青少年哮喘发生发展密切相关[7]。一项针对10篇相关文献的Meta分析显示，PM2.5浓度短期内上升可导致儿童哮喘住院人数增加，其导致的发作风险高于可吸入颗粒物(PM10)[8]。婴幼儿由于各系统和器官发育不完善，极易受环境中各种毒性物质的侵害。研究显示，围产期空气污染物暴露与儿童期哮喘发病及加重相关，改善空气质量有助于降低PM2.5对儿童哮喘的不良作用[9]。研究表明，小鼠胚胎期柴油机颗粒物(主要成分为PM2.5)暴露可导致其出生后对致敏原的反应性升高[10]。为探讨个体早期环境水平PM2.5暴露对免疫系统的影响，本研究在大鼠出生后使其吸入福州地区大气PM2.5建立暴露模型，观察PM2.5暴露对卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏或未致敏幼鼠部分免疫功能相关指标的影响，包括血浆IL-4、IL-5和IFN-γ、肺GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)和T细胞特异性转录因子(T-box expressed in T cells,T-bet)及脾脏miRNA-146a/b等的水平变化，并探讨其作用机制，阐明个体早期不良大气环境暴露对哮喘发生的影响及作用机制、儿童哮喘防控及大气污染指标的再修订提供参考[11，12]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠,雌性40只，体质量183～239 g，雄性20只，体质量325～400 g，购自福建医科大学的实验动物中心，合格证号：SCXK[闽]2012-0001。雌鼠实验前在SPF级饲养室中适应性喂养1周。

1.1.2主要试剂和设备 RNA提取试剂盒(Invitr-ogen)；OVA(Sigma)；RNA贮存液(Omega)；PCR试剂盒和TRIzol试剂(Invitrogen)；PM2.5暴露系统由俄亥俄州立大学公共卫生学院提供，暴露点距交通主干道25 m、距地面9 m，气流量300～350 L/min。外部气体导入暴露柜前通过颗粒物切割器滤除气动直径>2.5 μm的颗粒物，仅PM2.5被导入柜内(与环境PM2.5浓度相同)，导入对照柜的外部气体再经高效颗粒物阻拦装置(HEPA)过滤全部颗粒物[13]。便携式PM2.5检测器(CW-HAT200，宜兰环保工程)；垂直凝胶电泳系统(Bio-Rad)；光学显微镜(Olympus)；实时定量PCR仪(ABI)；光谱分析仪(北京博晖)；多功能酶标仪(TECAN)。

1.2方法

1.2.1大鼠分组、PM2.5暴露和OVA致敏 大鼠每笼按雌∶雄=2∶1交配，次日清晨行阴道分泌物涂片检查，见阴栓者为妊娠第0天。受孕雌鼠单笼饲养、未孕鼠继续交配过夜。本组雌鼠2 d内均成功受孕，置于对照柜中饲养以消除出前空气PM2.5的影响。孕鼠随机分为过滤空气-生理盐水组(FA-NS)、PM2.5-NS组、FA-OVA组和PM2.5-OVA组，每组10只。各组孕鼠于妊娠第21～22天自然分娩。幼鼠出生后第0～27天置于暴露柜中连续PM2.5暴露，同期对照鼠置于对照柜喂养，温度(23.5±1)℃、相对湿度(65±10)%，12/12 h昼夜节律照明，摄食、饮水不限。暴露装置进气口处空气PM2.5浓度值采用移动式PM2.5检测器检测，实验期间每天08:30、11:30和16:30各检测1次，取均值并与环境监测站同时间监测值进行比较。幼鼠出生后第9、15天分别腹腔注射OVA浓度为 0.25 μg/μl的氢氧化铝凝胶200 μl，第24～26天雾化吸入1% OVA 30 min，1次/d诱导过敏。未行致敏处理的幼鼠给予等量氢氧化铝凝胶。动物实验遵照中华人民共和国国家科学技术委员会“实验动物管理条例”规定，并经福建省妇幼保健院医院动物伦理委员会批准。

1.2.2标本收集及预处理 各组大鼠于第27天吸入麻醉后行安乐死。心内穿刺抽血，于含EDTA·2Na抗凝管中离心后取血浆。分离肺脏用于GATA3和T-bet含量检测；分离脾脏置于RNA贮存液中用于miRNA-146a/b检测。以母鼠为样本单位，将每窝鼠的血浆、肺脏或脾脏组织经预处理后合并为1份样本保存于-70℃待测。

1.2.3血浆炎症因子检测 采用夹心双抗ELISA法检测血浆IL-4、IL-5和IFN-γ水平，按照试剂盒说明书操作。

1.2.4Western blot检测肺组织GATA3、T-bet含量 组织样本经总蛋白提取、电泳、转膜、一抗和二抗反应后PVDF转膜、显影，图像处理系统检测各电泳条带灰度值，比较各组转录因子含量差异。

1.2.5RT-qPCR检测脾miRNA-146a/b水平 引物序列见表1，委托上海生工技术公司合成。以GAPDH为内参。提取样品总RNA逆转录合成cDNA。分别按miRNA-146a/b扩增要求设定循环反应条件，于PCR仪中扩增。采用SYBR®Green法进行qPCR反应，2-ΔΔCt法计算。

表1 基因引物序列Tab.1 Sequences of gene primer

2 结果

2.1吸入暴露点PM2.5水平和大鼠一般状况 大鼠暴露期间，暴露装置进气口周围PM2.5实测浓度为11.6～53.1 μg/m3，平均浓度为1.2 μg/m3，与同时期福州市5个监测点“杨桥西路”的监测值(31.8 μg/m3)接近，该监测点与暴露点距离最短。研究期间孕鼠、幼鼠全部存活，每窝9～15只。

2.2血浆炎症相关因子水平 PM2.5-NS组、FA-OVA组、PM2.5-OVA组血浆IL-4水平较FA-NS组显著升高(P=0.017、0.001、0.001)，PM2.5-OVA组较PM2.5-NS或FA-OVA组显著升高(P=0.001、0.011)，PM2.5-OVA组与FA-OVA差异无统计学意义(P=0.011)。FA-OVA或PM2.5-OVA组血浆IL-5水平较FA-NS组(P=0.001、0.002)或PM2.5-NS组(P=0.002、0.007)显著升高，PM2.5-NS组与FA-NS组、PM2.5-OVA组与FA-OVA组差异无统计学意义。FA-OVA组血浆IFN-γ水平较FA-NS、PM2.5-NS或PM2.5-OVA组显著升高(P=0.005、0.002、0.017)，其余3组差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组幼鼠血浆炎症相关因子水平Tab.2 Levels of inflammation-related factors in plasma of offspring

2.3肺GATA3和T-bet蛋白水平 FA-OVA或PM2.5-OVA组肺GATA3水平较FA-NS组显著升高(P=0.014、0.001)，PM2.5-OVA较PM2.5-NS显著升高(P=0.005)， 与FA-OVA组差异无统计学意义。FA-OVA、PM2.5-OVA组T-bet水平较FA-NS组(P=0.001)或PM2.5-NS组(P=0.001)、PM2.5-OVA组较FA-OVA组(P=0.049)均显著降低，PM2.5-NS组与FA-NS组差异无统计学意义。见图1、表3。

图1 GATA-3和T-bet蛋白电泳条带Fig.1 Electrophoresis strips of GATA-3 and T-bet proteins

表3 各组幼鼠肺组织GATA3、T-bet蛋白含量Tab.3 GATA3 and T-bet protein levels in lung tissue of offspring in each

2.4脾miRNA-146a/b表达变化 PM2.5-OVA组miRNA-146a表达较FA-NS组(P=0.001)、PM2.5-NS组(P=0.001)和FA-OVA组(P=0.037)显著升高，FA-OVA组较PM2.5-NS组显著升高(P=0.042)，PM2.5-NS组与FA-NS组差异无统计学意义(P=0.733)。FA-OVA或PM2.5-OVA组miRNA-146b表达较FA-NS组(P=0.007、0.001)或PM2.5-NS组(P=0.006、0.001)显著升高，PM2.5-NS组与FA-NS组(P=0.960)、PM2.5-OVA组与FA-OVA组差异无统计学意义(P=0.293)，见表4。

表4 各组幼鼠脾miRNA-146a/b表达水平Tab.4 miRNA-146a/b expression levels in spleen tissue of offspring in each

3 讨论

本研究在大鼠出生后早期吸入特定地区环境浓度的大气PM2.5，观察其对幼鼠免疫系统是否存在负面效应。PM2.5暴露使未致敏幼鼠血浆IL-4水平升高、使OVA致敏幼鼠血浆IL-4水平和脾组织miRNA-146a表达进一步升高、血浆IFN-γ水平降低。表明出生后早期PM2.5暴露可加重OVA致敏个体免疫系统损伤；未接触OVA的个体也可使特定免疫功能指标发生异常改变，提示环境PM2.5暴露可诱发或加重机体免疫功能异常，可能是导致或加重哮喘和其他免疫性疾病的有害环境因素之一。

免疫因子水平的改变可破坏免疫系统Th1、Th2动态平衡，导致免疫反应异常，后者是免疫系统的调控和效应细胞，在正常生理条件下处于动态平衡。IFN-γ是Th1的标志性细胞因子，IL-4、IL-5是Th2的特征性细胞因子，可表征Th1、2的免疫应答状况[14]。研究表明，PM2.5暴露导致成年大鼠气道反应性增高，诱导炎症反应，促进IL-4、IL-5分泌[15]。另有研究表明PM2.5暴露可导致成年大鼠循环血液中单个核细胞IL-4水平升高，但IFN-γ水平未见明显变化[16]。本研究表明，出生后早期PM2.5暴露不但可使IL-4水平显著升高，还可显著降低IFN-γ水平，提示个体发育早期PM2.5暴露对免疫系统具有不良效应，比成年期暴露更为严重，可能与个体早期免疫系统发育不完善、更易受不良环境因素影响有关。IFN-γ水平降低、IL-4水平升高使IFN-γ/IL-4比值更加偏离其平衡点，提示同时存在Th1功能不足和Th2功能亢奋。胎儿免疫系统存在生理性免疫抑制效应，Th1/Th2偏低可抑制母-胎免疫反应，该状况在出生后仍可持续一段时间，提示在出生后早期个体免疫系统较为脆弱。PM2.5暴露使IFN-γ和IL-4水平变化更为显著，进一步破坏Th1/Th2的功能平衡，对免疫系统的伤害也更为明显。个体早期PM2.5暴露可导致免疫功能异常、免疫性疾病易感性升高[17]。本研究中，不论是未致敏还是致敏幼鼠，PM2.5暴露后IL-5水平均未见明显变化，其在PM2.5暴露中的作用可能较小。

GATA3和T-bet在体内的功能复杂多样，在维持免疫系统正常功能中发挥重要调节作用，通过与IL-4、IFN-γ等炎症因子的基因启动子相结合，可调节Th1、Th2增殖、分化和免疫调节因子的分泌，是维持Th1/Th2平衡和稳态的重要调节因子[18]。本研究表明，出生后早期PM2.5暴露可下调OVA致敏幼鼠脾脏T-bet因子表达，GATA3因子表达在OVA致敏或未致敏幼鼠均有升高趋势，可导致Th1/Th2平衡失调。结合本研究结果和相关免疫调节机制可以认为，出生后早期PM2.5暴露影响幼体免疫系统作用的途径可能是通过上调T-bet、下调GATA3因子表达、破坏Th1/Th2动态平衡，下调Th1相关因子IFN-γ表达、上调Th2相关因子IL-4表达，导致个体早期免疫系统功能上调异常，促发哮喘和其他免疫性疾病。

脾miRNA-146a/b表达检测结果显示，PM2.5暴露可进一步上调OVA致敏幼鼠miRNA-146a表达，但未致敏幼鼠的表达无明显改变，表明在免疫系统已受损的情况下，miRNA-146a易受PM2.5暴露影响而发生改变；miRNA-146b则仅对OVA致敏产生反应。研究发现，IL-1β、IFN-γ等炎症因子可诱导支气管平滑肌细胞表达miRNA-146a/b[19,20]；miRNA-146a/b参与机体过敏反应，与哮喘等免疫相关疾病的发生密切相关[21,22]。进一步研究发现，miRNA-146a是免疫系统及炎症反应的负调节因子，与免疫性疾病的关系比miRNA-146b更为密切[19]。本研究结果显示脾miRNA-146a/b表达发生变化，提示miRNA-146a在PM2.5暴露损伤效应中可能发挥更大作用，与上述研究结果类似，但其在PM2.5暴露损伤中的作用机制需要进一步研究。

流行病学研究表明个体早期空气PM2.5暴露与哮喘及其他免疫性疾病的发生相关。欧洲的一项研究表明，出生后早期空气污染物暴露可增加儿童和青少年哮喘发生的风险，减少空气污染物可降低儿童哮喘发病率[23]。国内研究也有类似报道。Zhang等[24]在山东莱芜开展的调查表明PM2.5与儿童咳嗽变异性哮喘发病有关；Chen等[9]针对台湾17 931例居住点与大气监测站距离小于1 km学龄期儿童的调查也显示大气PM2.5暴露与儿童哮喘发病相关。母鼠妊娠期气道滴注大气颗粒物可使幼鼠出生后早期出现免疫系统功能异常[25]。本实验使大鼠吸入环境浓度PM2.5，比实验室条件下设定浓度的PM2.5暴露更能真实地复制早期个体环境大气PM2.5的暴露效应。实验点的空气PM2.5浓度实测值为31.2 μg/m3，接近同时间监测站的监测值31.8 μg/m3，表明实验点的PM2.5暴露水平可较好地反映福州地区个体暴露平均水平。但本研究也存在不足，在暴露的模拟方面，为使研究条件一致，设计为24 h持续暴露，暴露时程虽已设置较长(出生后连续暴露4周)，但实际暴露在胚胎发育甚至更早期的配子发育阶段已持续存在；对照柜仅滤除PM2.5，其他污染物(如O3等气态污染物)的联合效应未排除，观察指标也有待进一步完善，包括同时针对母体的观察。尽管如此，本研究显示出生后早期环境水平PM2.5暴露对免疫功能指标存在不良影响。鉴于福州地区的空气PM2.5水平低于全国多数城市，个体早期较低水平PM2.5暴露导致的不良健康效应应引起重视。婴幼儿时期在类似环境下的PM2.5暴露是否存在不良效应有待进一步研究。